Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола

• Автор: Дубровина, Александра Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 117 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Стильбены растений семейства Vitaceae
1.2. Биологически активные свойства резвератрола
1.3. Биосинтез резвератрола и его производных
1.4. Регуляция биосинтеза стильбенов
1.4.1. Регуляция экспрессии генов биосинтеза стильбенов
1.4.2. Сигнальные пути, регулирующие биосинтез стильбенов
1.5. Биосинтез резвератрола и его производных клетками растений, бактерий и грибов
1.6. Влияние трансформации клеток растений геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на их морфологию и метаболизм
1.7. Кальциевая сигнальная система
1.7.1. Кальциевая сигнальная система и ее роль во внутриклеточной сигнальной сети
1.7.2. Участие кальциевой сигнальной системы в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов растений
1.7.3. Са2+-зависимые протеинкиназы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал и клеточные культуры
2.2. Обработка элиситорами и другими эффекторами
2.3. Селекция клеток на фторфенилаланине
2.4. Генетическая трансформация
2.5. Выделение нуклеиновых кислот и синтез кДНК
2.6. Условия проведения ПЦР
2.7. Секвенирование ДНК
2.8. Количественный и полуколичественный анализ экспрессии генов rolB, фенилаланин-аммиак-лиаз (PAL), стильбен синтаз (SI'S) и Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK)
2.9. Определение содержания стильбенов в культурах V amurensis
2.10. Статистический анализ полученных результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Накопление биомассы и биосинтез стильбенов каллусными культурами V amurensis
3.2. Увеличение продукционных характеристик культуры V2
3.2.1, Обработка элиситорами
3.2.2. Эффект фенилаланина и селекция клеток на фторфенилаланине
3.3. Трансформация клеток V. amurensis геном rolB и отбор фенотипических линий
3.4. Доказательство и оценка экспрессии гена rolB в культурах клеток V.
amurensis
3.5. Накопление биомассы и биосинтез стильбенов го/В-трансгенными клеточными культурами V. amurensis
3.6. Влияние ингибитора Туг-фосфатаз фениларсиноксида и общего ингибитора фосфатаз ортованадата натрия на рост и содержание резвератрола в клеточных культурах V. amurensis
3.7. Экспрессия генов PAL и STS в контрольной и го/В-трансгенных клеточных культурах V. amurensis
3.8. Влияние салициловой кислоты на экспрессию генов PAL и STS в контрольной культуре клеток V. amurensis
3.9. Влияние ингибиторов Са2+-каналов на прирост биомассы и синтез резвератрола в каллусных культурах V. amurensis
3.10. Экспрессия генов CDPK в клеточных культурах V amurensis
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

(Lecourieux et al., 2006; Ramani and Chelliah, 2007). Так, например, известно, что поступление кальция из внеклеточного пространства необходимо для продукции фитоалексинов (Kurosaki et al., 1987; Choi and Bostock, 1994; Tavemier et al., 1995; Ishihara et al., 1996; Mithofer et al., 1999; Blume et al., 2000; Ramani and Chelliah, 2007). В данных работах показано, что под воздействием элиситора в результате повышения [Са2+]щгг продукция фитоалексинов возрастает, в то время как ингибирование Са2+-каналов, хелатирование Са2+ или блокирование его внутриклеточного перемещения с помощью специальных агентов значительно снижает их накопление. Подтверждая эти результаты, Лекоурикс с соавторами (Lecourieux et al., 2002) показали, что подавление увеличения [Са2+]Ц11Х усиливает в свою очередь подавление аккумуляции транскриптов PAL, первого фермента в биосинтезе соединений фенилпропаноидного ряда и поэтому ключевого для биосинтеза большинства фитоалекспнов. С другой стороны существуют публикации, в которых результаты указывают на обратную зависимость биосинтеза некоторых вторичных метаболитов от притока Са2+ в клетки (Cacho et al., 1995; Ning et al., 1998; Cacho et al., 1999; Sanchez-Sampedro et al., 2005). Показано, что в rolB-трансгенной культуре клеток R. cordifolia нарушен гомеостаз Са2+ (Bulgakov et al., 2003). Рост /'о/5-трансгенных культур клеток R. cordifolia был более устойчив к дефициту Са2+ в среде и к ингибиторам Са2+-каналов, в то время как добавление этих веществ в питательную среду не оказывало влияния на аккумуляцию антрахинонов. Авторы предполагают, что в го/5-трансгенной культуре клеток R. cordifolia проницаемость Са2+-каналов выше, чем в контрольной культуре клеток.
Известно, что CDPK, основные сенсоры кальция в растительных клетках, вовлечены в передачу сигнала при возникновении стрессовой ситуации (Cheng et al., 2002). Сигнальные пути, ведущие к устойчивости растения к патогенам, а также холоду, засолению и засухе, опосредованы специфическими изоформами CDPK (Ludwig et al., 2004). Обработка клеточных культур Nicotiana tabacum и