Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

• Автор: Маракасова, Екатерина Семеновна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Оглавление
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Туляремия
1.2. Механизм инфекционного процесса, вызываемого Ргапс 'иеИа
1.3. Липидные посттрансляционные модификации и методы их изучения
1.4. Превалирование
1.4.1. Механизм пренилирования
1.4.2. Предсказание пренилирования белков
1.4.3. Пренилирусмые белки эукариот
1.4.4. Белки патогенных микроорганизмов, пренилируемые в клетках эукариот..
1.4.5. Небелковое пренилирование у бактерий
1.5. Ингибиторы пренилирования
1.6. Заключение
2. Материалы и методы исследований
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования
2.2. ДНК манипуляции и клонирование
2.3. Трансформация бактерий
2.4. Оценка дефективности роста бактерий
2.5. Биоинформатические методы и статистика
2.6. Культура клеток и условия культивирования
2.7. Трансфекция эукариотических клеток
2.8. Подсчет количества клеток
2.9. Инфекция эукариотических клеток, оценка способности бактерий инфицировать и размножаться внутри эукариотических клеток
2.10. Лизис клеток
2.11. Определение концентрации белка
2.12. Электрофорез в ПААТ и иммуноблотинг
2.13. Окраска ПААТ

2.14. Очистка и концентрирование белковых фракций
2.15. Определение хитииазной активности
2.16. Клик-Иг метод
3. Результаты собственных исследований
3.1 Разработка генетической системы для комплементаций делеционных мутаций генов в РгапсРсИа и ее тестирование
3.1.1. Разработка и создание вектора с полилинкером для молекулярного клонирования
3.1.2. Клонирование ФТН-0
3.2. Клонирование генов из генома Р. ш1агет1з БСНИ Б
3.2.1. Биоинформатические исследования
3.2.2. Клонирование генов ФТТ-0482, ФТТ-0502, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в вектор для экспрессии в эукариотических клетках
3.2.3. Экспрессия и изучение пренилирования белков в клетках человека
3.3. Изучение пренилирования белков Р. пойс!(1а Ш12 методом инфекций культуры клеток
3.4. Клонирование и анализ гена ФТН-0
4. Обсуждение результатов исследований
Выводы
Список использованной литературы
Список использованных сокращений
Список иллюстративного материала
ПРИЛОЖЕНИЯ
Введение
Туляремия - это инфекционное заболевание, характеризующиеся воспалительной модификацией ворот входа инфекции. Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни). Это заболевание относится к природно-очаговым зоонозам разных видов грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, сумчатых, хищников, копытных, птиц, амфибий, рыб и беспозвоночных (более ВО видов животных) [1]. Также человек может заразиться при вдыхании аэрозолей, при таком способе инфицирования развивается легочная форма туляремии.
Эндемические очаги туляремии регулярно проявляются на территории Российской Федерации и соседних стран [5]. Возбудителем туляремии является грамотрицательпая неподвижная кокоподобная палочка РгапЫьеИа пйагет'ю. Бактерии Р. ш1агетР считаются очень контагиозными из-за очень малой инфекционной дозы, считается, что 10 бактериальных клеток [46] способны вызвать заболевание человека. Именно из-за такой низкой инфекционной дозы и легкости распространения с аэрозолями Р. Ш1агетк причисляют к бактериям, которые потенциально можно использовать в качестве биологического оружия [92]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес К ийагетк в список особо опасных агентов класса А [69]. В Российской Федерации согласно санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 (прил.1) по классификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека Р Ьйагет'ю отнесен ко II группе патогенности.
В последнее десятилетие накопилось огромное количество данных, полученных в результате секвенирования геномов, на данный момент полностью секвенировано более десятка геномов разных штаммов РгапЫБеИа, в том числе Р. Ш1аге1шя 8 С МП 84. Для изучения функций генов Ргапс1.че11а созданы библиотеки мутантных штаммов, непатогенных для человека [75]. Вместе с тем, генетические

семейств Ras, Hdj2, ядерных ламинов и RheB подвергаются фарнезилировашпо [76], а семейств Rac, RhoA, Cdc42 и с-субъединицы гетеротримерных G-белков — геранилгеранилированиго [105]. Многие пренилируемые белки хорошо изучены в качестве участников процесса передачи сигналов. Дополнительные функции пренилированных белков входит участие в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза и общего метаболизма. Полное подавление процесса пренилирования приводит к гибели клеток человека [76, 165].
Пренилированные ГТФазы семейства Ras прикреплены к мембране клетки и передают сигнал от поверхностных рецепторов к транскрипционным факторам, работающим внутри ядра. Белки семейства ГТФаз Rho могут быть расположены как в плазматической мембране (Racl), так и на эндомембранах (RhoH) или же эндосомах (RhoD) [76, 153]. С-концы белков H-Ras и N-Ras содержат как пренилированный цистеин в позиции 186, так и пальмитоилированпый цистеин в позиции 181 [113], который обусловливает выход этого белка из комплекса Гольджп и его транспорт к мембране клетке [113]. Для пренилирования Racl также показана необходимость пальмитоилироваиия, которое происходит по цистеину в позиции 178 и определяет его локализацию в участках мембраны, соответствующих местам прикрепления актипового цитоскелета [113].
Ядериые ламины образуют фибриллярную сеть, поддерживающую внутреннюю мембрану ядра. Эти белки также контролируют организацию хроматина, репликацию ДНК и закрепление норовых комплексов в процессах роста и деления клетки [76]. Заякоривание ламина на внутренней мембране ядра является необходимым условием для его нормального функционирования [76], [115]. Большинство мутаций в ламин-кодирующих генах приводят к нарушению нормальной функции этих белков, и развитию первичных ламинопатий, поражающих поперечнополосатую мускулатуру, периферические нервы и жировую ткань, что приводит к дегенерации внутренних органов и преждевременному старению [76, 115].