Морфофизиологические реакции трансгенных растений табака на инсерцию гетерологичного гена HMG1

• Автор: Ермошин, Александр Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 113 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
1. Обзор литер атуры
1.1. Ген ЯМС?, кодируемый им фермент
1.2. Семейство генов ЯМ7 у растений
1.3. Регуляция активности фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы
1.4. Роль генов семейства ЯЖ? в жизни растений
1.5. Природные изопреноидные соединения и пути их синтеза
1.6. Роль изопреноидов в жизни растений
1.6.1. Роль стеринов в росте и развитии растений
1.6.2. Роль изопреноидов в устойчивости растений к стрессорам
1.7. Роль сесквитерпенов в микоризации растений
1.8. Трансгенные растения с геном hmgl
1.9. Копийность трансгенной вставки и наследование инсерции
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Получение трансгенных линий растений
2.2.2. Молекулярно-генетические методы
2.2.3. Физиолого-биохимические исследования
2.2.4. Анатомо-морфологические методы
2.3. Бактериальные штаммы, антибиотики, среды для культивирования, реактивы
2.4. Статистическая обработка данных
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение трансгенных линий МсоНапа шЬасит Ь

3.2. Копийность вставки и её наследование
3.3. Определение экспрессии целевого гена в трансгенных
растениях табака
3.4. Биохимическое исследование полученных трансгенных линий
3.4.1. Содержание липидов и стеринов в тканях табака
3.4.2. Включение 14С-фотоассимилятов в липофильные фракции листьев растений табака
3.5. Влияние экспрессии гетерологичного гена кт%1 на
морфологию растений табака
3.6. Влияние экспрессии гетерологичного гена hmgl на
организацию фотосинтетического аппарата листа табака
3.6.1. Структура мезофилла листа растений табака
3.6.2. Содержание фотосинтетических пигментов
3.7. Влияние гена кт^1 на репродуктивную сферу растений
3.7.1. Содержание антоцианов в венчиках цветков
3.7.2. Влияние экспрессии гена Ьт%1 на всхожесть семян
3.7.3. Влияние гена hmgl на мужскую генеративную сферу
3.7.4. Исследование женской генеративной сферы
3.8. Устойчивость трансгенных растений к стрессовым факторам
3.8.1. Устойчивость к высоким дозам ионов меди
3.8.2. Реакция растений табака на окислительный стресс,
вызванный паракватом
3.8.3. Устойчивость к фитопатогенам
3.9. Влияние гена hmgl на степень микоризации трансгенных растений табака
Заключение
Выводы
Литература

Список сокращений
АФК - активные формы кислорода
БАЛ - 6-бензиламинопурин, синтетический цитокинин
ИМК — индекс мембран клетки
ИУК - индолилуксусная кислота, синтетический ауксин КОХ - клеточный объем хлоропласта МЕР - метилэритритолфосфат МС - среда Мурасиге и Скуга
НУК - нафтилуксусная кислота, синтетический ауксин ОМГ-КоА - фермент З-окси-З-метилглутарил коэнзим А редуктаза ОТ - обратная транскрипция п.о. - пар оснований
ПОЛ - перекисное окисление липидов мембран
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СОД - фермент супероксид дисмутаза
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ТМ - тяжелые металлы
ТХУ - трихлоруксусная кислота
УППЛ - удельная поверхностная плотность листа
35Б СаМУ - промотор вируса мозаики цветной капусты
СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид
ЯМ?, кт£ - ген, кодирующий З-окси-З-метилглутарил коэнзим А редуктазу
1В - питательная среда для бактерий Лурия-Бертани прШ- ген неомицинфосфотрансферазы II

буфера (1% СТАВ, 50 мМ трис-НС1, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА). Выделенные плазмиднуго и растительную ДНК осаждали изопропанолом в виде натриевой соли. Осадок трижды отмывали от избытка соли и фенольных соединений 75% этанолом. Препарат ДНК высушивали в потоке стерильного воздуха и растворяли в ТЕ буфере (Маниатис, 1984).
Определение трансгенной природы бактериальных клеток и регснерантов растений. Трансгенную природу растений определяли методом ПЦР. Амплификацию проводили в термоциклере MJ MINI Bio-Rad (США) или «Терцик» (ДНК-технологии, Россия). Для амплификации использовали ДНК-полимеразу Taq, нуклеотиды и буфер производства «Евроген» (Россия) или готовую смесь для ПЦР «Screen Mix» («Евроген», Россия). Коммерческие реактивы использовали в соответствии с рекомендациями производителя. В смесь вносили примерно 0,5 мкг геномной ДНК, 1 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ смеси дНТФ, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq.
Использовали следующие праймеры:
Для доказательства наличия селективного гена nptlh forward - tattcggctatgactgggca, reverse - gccaacgctatgtcctgata.
Для подтверждения инсерции целевого гена hrngT. forward - atggatctccgtcggaggcc, reverse - caaccttcggttgtagccataggaa.
Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующих условиях амплификации: 94°С - 5 мин; 30 циклов: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, затем 72°С - 7 мин.
Разделение продуктов ПЦР проводили путем электрофореза в 0,8% агарозном геле в буфере ТАЕ с последующей визуализацией.
Доказательство отсутствия агробактериалыюй контаминации. Для доказательства полной элиминации агробактерий в растениях-