Митохондриальные энергорассеивающие системы растений при действии низких температур

• Автор: Грабельных, Ольга Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 482 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИТОХОНДРИЙ И ИХ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ
1.1.1. Структурная организация митохондрий
1.1.2. Комплексы и суперкомплексы ЭТЦ митохондрий
1.1.2.1. Комплекс I дыхательной цепи митохондрий (НАДН: убихинон оксидоредуктаза) и окисление малата
1.1.2.2. Комплекс II дыхательной цепи митохондрий (сукцинат: убихинон оксидоредуктаза) и окисление сукцината
1.1.2.3. Убихинон
1.1.2.4. Комплекс III дыхательной цепи митохондрий (убихинол: цитохром с редуктаза) или /^-комплекс
1.1.2.5. Цитохром с
1.1.2.6. Комплекс IV дыхательной цепи митохондрий (цитохром с оксидаза или цитохромоксидаза)
1.1.2.7. Комплекс V дыхательной цепи митохондрий (Н+-АТФ-синтаза)
1.1.2.8. Суперкомплексы дыхательной цепи митохондрий
1.1.3. Альтернативные ферменты в ЭТЦ митохондрий растений
1.1.3.1. Альтернативная убихинол-оксидаза
1.1.3.2. Альтернативные ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы
1.2. МИТОХОНДРИИ КАК ИСТОЧНИК АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ
1.3. ПЕРЕНОСЧИКИ И КАНАЛЫ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ
1.3.1. АТФ/АДФ-антипортер
1.3.2. К+АТР канал
1.3.3. Разобщающие белки
1.4. КОНТАКТНЫЕ УЧАСТКИ ВНУТРЕННЕЙ И НАРУЖНОЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН
1.4.1. Система импорта белков через мембраны митохондрий
1.4.2. Высокопроницаемая митохондриальная пора
1.5. УЧАСТИЕ МИТОХОНДРИЙ В ОКИСЛЕНИИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
1.6. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС И МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
1.6.1. Ответ растений на низкотемпературный стресс
1.6.2. Липиды и жирные кислоты клеточных мембран: десатуразы и фосфолипазы растений
1.6.3. Стрессовые белки растений
1.6.4. Роль ионов кальция при адаптации к холоду
1.6.5. Дыхание растений и альтернативные пути дыхания в ответной реакции растений на низкотемпературный стресс

1.7. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, ПОСТАНОВКА ЦЕЛИ
ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Температурная обработка
2.3. Определение изменений ростовой реакции проростков
2.4. Определение выживаемости
2.5. Определение содержания углеводов
2.6. Определение содержания БН-групп
2.7. Определение общего содержания активных форм кислорода
2.8. Определение пероксида водорода
2.9. Определение диеновых конъюгатов
2.10. Определение температуры тканей
2.11. Выделение митохондрий
2.12. Очистка митохондрий
2.13. Получение субмитохондриальных фракций
2.14. Определение активности ферментов
2.14.1. Гидроксипируватредуктаза
2.14.2. Каталаза
2.14.3. Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа
2.14.4. «Внешняя» НАД(Ф)Н-дегидрогеназа типа II
2.14.5. «Внутренняя» НАДН-дегидрогеназа типа II
2.15. Полярографический анализ
2.16. Определение мембранного потенциала митохондрий (Д1|/мит)
2.17. Получение и анализ метиловых эфиров жирных кислот
2.18. Определение продуктов перекисного окисления липидов
2.19. Определение набухания митохондрий
2.20. Получение препаратов стрессового белка БХШ 310 и проведение экспериментов с БХШ
2.20.1. Выделение цитоплазматических белков
2.20.2. Фракционирование белков сульфатом аммония
2.20.3. Фракционирование белков с помощью гель-фильтрации
2.20.4. Подготовка к работе неиммунной сыворотки и антисыворотки против БХШ
2.20.5. Определение влияния конститутивно синтезируемой и стрессовой форм БХШ 310 на активность митохондрий озимой пшеницы
2.20.6. Определение влияния БХШ 310 и БСА на активность митохондрий разных видов растений
2.20.7. Определение ассоциации БХШ 310 с митохондриями озимой пшеницы
2.20.8. Определение способности БХШ 310 восстанавливать цитохром с
2.20.9. Определение термогенерации изолированными митохондриями в присутствии БХШ
2.21. Определение разобщающей активности экзогенных свободных жирных кислот и их способности быть субстратом окисления
2.22. Выделение РНК и получение кДНК
2.23. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ГГЦР-РВ)
2.24. Экстракция белков
2.25. Электрофорез в ПААГ с ДДС-ИА
2.26. Вестерн-блоттинг
2.26.1. Процедура иммуноблоттинга
2.26.2. Используемые антитела
2.27. Определение молекулярных масс полипептидов
2.28. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ ХОЛОДОВОЕ ЗАКАЛИВАНИЕ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ И СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
3.1.1. Связь морозоустойчивости этиолированных проростков озимой пшеницы с синтезом дегидринов, содержанием АФК, интенсивностью дыхания и вкладом в дыхание альтернативного пути
3.1.1.1. Повышение морозоустойчивости этиолированных проростков озимой пшеницы в процессе холодового закаливания
3.1.1.2. Синтез ССЖ-белков в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы под влиянием закаливающих температур
3.1.1.3. Содержание АФК в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы после воздействия закаливающих к холоду температур
3.1.1.4. Изменение интенсивности общего и устойчивого к цианиду дыхания в побегах проростков озимой пшеницы после действия закаливающих к-холоду температур
3.1.1.5. Влияние отрицательной температуры на содержание АФК в незакаленных и закаленных проростках озимой пшеницы
3.1.1.6. Влияние отрицательной температуры на термогенез незакаленных и
закаленных проростков озимой пшеницы
3.1.2. Изучение морозоустойчивости суспензионной культуры клеток озимой пшеницы и параметров, определяющих эффективность холодового закаливания
3.1.2.1. Влияние низких положительных температур на морозоустойчивость клеток суспензионной культуры озимой пшеницы
3.1.2.2. Влияние холодового шока на содержание АФК, интенсивность дыхания и вклад альтернативного пути в дыхание в клетках контрольной и
закаленной суспензионной культуры озимой пшеницы
3.1.3. Сравнительный анализ реакции этиолированных проростков и гетеротрофной суспензионной культуры озимой пшеницы на действие низких положительных и отрицательных температур

Молярное соотношение компонентов окислительного
фосфорилирования в митохондриях различньгх организмов различается. Стехиометрические соотношения между комплексами I : II : III : IV в митохондриях сердца быка составляют 1:1,3:3:6,7 [624], 0,5 АТФ-синтазы, 3-5 единиц АТФ/АДФ-антипортера для каждой цитохром с оксидазы (комплекс IV) и одну НАДН/НАДФ трансгидрогеназу на комплекс I [237]. У растений, данных о соотношении компонентов дыхательной цепи мало. Согласно BN-PAGE, содержание комплексов I, III, IV и V у картофеля было равным [383], так же как и в модели организации мегакомплекса митохондрий картофеля «дыхательная цепочка», построенной с помощью проекционных карт 2D, где отношение комплексов I, III и IV составляет 1:1:1 [232]. В то же время по данным иммуноблоттинга соотношение комплексов дыхательной цепи в разных тканях растений может отличаться: в фотосинтетически активных органах (листьях, стеблях, цветках) содержится больше комплекса I, а в гетеротрофных тканях (в каллусах) - комплекса IT [258].
Поскольку белки, входящие в состав компонентов системы трансформации энергии в митохондриях, синтезируются как на цитоплазматических, так и на митохондриальных рибосомах, то для сохранения функциональной активности митохондрий необходимо контролировать качество белков и их правильную сборку в определенном стехиометрическом соотношении. При этом важно не только контролировать качество индивидуальных белков и их комплексов, но и формирование самих органелл или их субклеточных компартментов, что возможно, реализуется с помощью принципов «отбора по функциональным критериям» и «стабилизации функционированием» [84].
Последовательность реакций дыхательной цепи начинается с
окисления НАДН убихиноном (в реакции участвует комплекс I), далее
восстановленный убихинон окисляется системой Q-цикла в комплексе III,
затем электроны от цитохрома с/ поступают на цитохром с, который
выступает как восстановитель для терминального участка дыхательной цепи