Оценка вариабельности ДНК-маркеров в каллусной ткани пшеницы (Triticum aestivum L.) после криосохранения

• Автор: Соловьева, Александра Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Криосохранение тканей и органов Роасеае
1.1.1. Объекты криосохранения
1.1.2. Физиологическое состояние растительного материала
1.1.3. Подготовка растительного материала к замораживанию
1.1.4 Защита культуры in vitro с помощью криопротекторов
1.1.5. Дегидратация
1.1.6. Инкапсуляция
1.1.7. Методы замораживания
1.1.8. Оттаивание
1.1.9. Отмывание растительного материала от криозащитных растворов
1.1.10. Восстановление роста
1.1.11. Частота восстановления роста растительного материала
Т. aestivum после различных протоколов криосохранения
1.2. Стабильность растительного материала после криосохранения
1.2.1. Фенотипические изменения
1.2.2. Вариабельность тканей и органов растений на биохимическом уровне
1.2.3. Стабильность растительного материала на цитологическом
уровне
1.2.4. Вариабельность последовательностей ДНК
1.2.5. Тип сохраняемой ткани и генетическая вариабельность
1.2.6. Влияние протокола криосохранения на изменчивость растительного материала
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Молекулярный анализ ДНК
2.3. Получение и культивирование каллусных тканей Т. aestivum
2.4. Регенерация и культивирование растений

2.5. Получение самоопыленных линий
2.6. Криосохранение каллусов
2.7. Оценка восстановления каллусных тканей после отдельных стадий криосохранения
2.8. Определение содержания воды
2.9. Оценка способности каллусных тканей к морфогенезу
2.10. Статистическая обработка данных
2.11. Анализ ДНК-фрагмента
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика объекта и разработка условий исследования
3.1.1. Выбор и характеристика праймеров
3.1.2. Оценка генетической однородности растений трех сортов 50 Т. аевИуит
3.1.3. Выбор объекта исследования
3.1.4. Криосохранение каллусов Т. ае.яНхит
3.2. Исследование стабильности растительного материала после криосохранения методом дегидратации
3.2.1. Первая серия опытов
3.2.2. Вторая серия опытов
3.2.3. Уровень изменчивости растительного материала Т. аезйуит
после отдельных этапов криосохранения методом дегидратации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в качестве самого надежного способа долговременного сохранения генетических ресурсов рассматривается хранение культивируемых тканей растений при температуре жидкого азота (-19б°С). Криогенное хранение позволяет исключить вероятность потери ценных образцов и сократить материальные затраты на поддержание коллекций (Engelmann, 2004; Panis, Lambardi, 2005),
Криосохранение тканей растений, культивируемых in vitro, включает несколько стадий: введение в культуру, подготовку к замораживанию,
замораживание, криогенное хранение, оттаивание, восстановление роста и регенерацию растений. Существует вероятность того, что каждый из перечисленных этапов может оказывать влияние на генетическую стабильность растительного материала, поскольку из-за воздействия физических, химических и физиологических факторов живые клетки могут находиться в состоянии стресса и в результате этого в их геноме возникать различные отклонения.
Данные о сохранении стабильности генома культивируемых тканей растений после процедуры криосохранения довольно противоречивы. Во многих работах показана генетическая стабильность объектов после криосохранения выполненного с помощью целого ряда методик (Harding, 2004; Panis, Lambardi, 2005). Многие ученые сообщали о том, что при исследовании образцов после хранения в жидком азоте не было обнаружено изменений на различных уровнях организации (Harding, 2004; Panis, Lambardi, 2005). Однако в ряде исследований после полной процедуры криосохранения были выявлены изменения последовательностей ДНК, но они не позволили выяснить какие именно этапы криосохранения могут оказывать дестабилизирующее влияние на геном.
Более детальные исследования были посвящены оценке генетической стабильности растительного материала, восстановленного после отдельных этапов замораживания в жидком азоте с применением медленного замораживания в сочетании с обработкой криозащитными веществами (Aronen et al., 1999; Urbanova et al., 2006) и витрификации в растворах криопротекторов с последующим быстрым погружением в жидкий азот (Kaity et al., 2008; Sanchez et al., 2008). В этих исследованиях после предварительного культивирования растительных тканей не

al., 1999). Кроме того, австралийские исследователи отмечали появление вариаций как после оттаивания апексов С. papaya, так и уже после этапа обработки витрифицирующим раствором PVS2 (Kaity et al., 2008).
Протокол инкапсуляции-дегидратации не включает в себя' использование смесей криопротекторов. Оценка фенотипических характеристик, биохимическое исследование, хромосомный анализ и анализ последовательностей ДІЖ действительно подтвердили стабильность, ряда растительных объектов, восстановленных после данного метода криосохранения (Benson et al., 1996; Gonzalez-Amao et al., 1999; Wu et al., 2001; Scocchi et al., 2004; Condello et al., 2009; Nair, Reghunath, 2009; Rey et al., 2009). Однако некоторые исследователи отмечали небольшое расхождение цитометрического индекса у хромосом (Surenciski et al., 2007), а также различия RAPD- (Dixit et al., 2002; Zarghami et al., 2008) и AFLP -профилей (Martin, Gonzalez-Benito, 2005; Martin, Cervera, 2009) между оттаянным и контрольным растительным материалом.
После процедуры криосохранения изменчивость, может возникать как в результате действия этапов протокола криогенного хранения, так и в результате культивирования тканей in vitro. Например, в исследовании генетической стабильности эмбриогенных клонов Picea glauca (DeVemo et al., 1999) и каллусов Phoenix dectilifera (Bekheet et al., 2007) исследователи отмечали, что обнаруженные ими изменения RAPD-маркеров были вызваны именно культивированием тканей, а не условиями криосохранения. К таким же выводам пришли ряд ученых, проводившие анализ биометрических характеристик растений Caryophyllaceae ornamentals (Fukai et al., 1991), S. tuberosum (Harding, Staines, 2001), S. ajficinaritm (Martinez-Montero et al., 2002) и Fragaria x ananassa (Medina et al., 2007), восстановленных после замораживания тканей в жидком азоте.
Несмотря на многолетние исследования в области генетической стабильности растительного материла после криосохранения, трудно с уверенностью говорить об отсутствии влияния на нее различных протоколов замораживания в жидком азоте, поскольку для этого недостаточно данных (Табл. 4). Наибольшее количество работ выполнено в рамках анализа методов медленного замораживания, инкапсуляции-дегидратации и витрификации. Протоколы замораживания в каплях, инкапсуляции-витрификации и дегидратации остаются почти не исследованными.