Активация программируемой клеточной гибели в суспензионных культурах клеток растений в условиях пониженных температур

• Автор: Любушкина, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 181 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Программируемая клеточная гибель: особенности реализации процесса у растений и его физиологическая роль
1.1.1. История изучения процесса клеточной гибели
1.1.2. Возможные пути реализации клеточной гибели: апоптоз, автофагия и некроз
1.1.3. ПКГ у растений и животных. Сходства и различия
1.1.3.1. Структурно-морфологические (цитологические) изменения клеток при ПКГ
1.1.3.2. Молекулярно-биологические и биохимические особенности ПКГ у растений и животных
1.1.3.2.1. Сигнальные молекулы, участвующие в активации ПКГ
1.1.3.2.2. Ферменты, осуществляющие реализацию программы ПКГ
1.1.3.2.3. Пути реализации ПКГ в животной и растительной клетках
1.1.3.2.4. Регуляция процесса ПКГ у животных и растений
1.2. Влияние низких температур на физиолого-биохимические процессы у растений
1.2.1. Повреждения растительных клеток, вызванные понижением температуры внешней среды
1.2.2. Механизмы защиты от повреждений, вызванных низкими температурами
1.2.2.1. Изменения состава и свойств клеточных мембран при снижении температуры
1.2.2.2. Изменение белкового синтеза под действием низких температур: синтез стрессовых белков
1.2.2.3. Накопление низкомолекулярных криопротекторов
1.2.2.4. Дыхательный метаболизм при низких температурах
1.2.3. Низкие температуры как возможные факторы активации и развития ПКГ
1.3. Выводы из обзора литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Температурная обработка
2.3. Микроскопические методы (световая и флюоресцентная микроскопия)
2.3.1. Определение выживаемости клеток
3.3.2. Определение содержания АФК в клетках
2.3.3. Определение электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране

2.4. Изучение прироста биомассы
2.5. Определение дыхательной активности
2.6. Выделение белка
2.6.1. Выделение суммарного белка
2.6.2. Получение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций
2.7. Проведение электрофореза в ПААГе с ДДС-Ыа
2.8. Окраска и обесцвечивание гелей
2.9. Вестерн-блоттинг
2.10. Анализ жирнокислотного состава общих липидов: экстракция и метилирование жирных кислот
2.11. Выделение ДНК
2.12. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение влияния низких положительных температур на формирование механизмов низкотемпературной адаптации в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы
3.1.1. Влияние предварительной обработки никими положительными температурами на устойчивость проростков и клеток суспензионной культуры озимой пшеницы к последующему действию отрицательной температуры
3.1.2. Изучение формирования механизмов низкотемпературной адаптации в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы при действии низких положительных температур
3.1.2.1. Изменение жирнокислотного состава клеток суспензионной культуры озимой пшеницы, подвергнутых длительному воздействию низких положительных температур
3.1.2.2. Влияние низких положительных температур на синтез дегидринов в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы
3.1.2.3. Изучение интенсивности дыхания и вклада альтернативного цианидрезистентного пути у клеток суспензионной культуры озимой пшеницы в условиях низкотемпературной обработки
3.1.2.4. Изменение содержания АФК в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы в контрольных условиях и после воздействия низких положительных температур
3.2. Влияние отрицательных температур на показатели жизнеспособности клеток суспензионных культур озимой пшеницы и сахарного тростника
3.2.1. Выбор отрицательной температуры для активации процесса гибели в суспензионной культуре клеток сахарного тростника
3.2.2. Изменение скорости прироста биомассы суспензионных культур растений под влиянием отрицательной температуры
3.2.2.1. Влияние отрицательной температуры на прирост биомассы суспензионной культуры озимой пшеницы
3.2.2.2. Влияние отрицательной температуры на прирост биомассы суспензионной культуры клеток сахарного тростника
3.2.3. Влияние отрицательной температуры на динамику гибели и процесс конденсации протопласта клеток в суспензионных культурах растений

3.2.3.1. Изучение влияния отрицательной температуры на гибель клеток и конденсацию протопласта в контрольной и предварительно обработанных при низких положительных температурах культурах клеток озимой пшеницы
3.2.3.2. Влияние отрицательной температуры на динамику гибели клеток суспензионной культуры сахарного тростника
3.2.4. Влияние отрицательной температуры на интенсивность дыхания и вклад альтернативного цианидрезистентного пути у клеток суспензионных культур растений
3.2.4.1. Изменения интенсивности дыхания и вклада альтернативного цианидрезистентного пути у клеток контрольной и закаленных суспензионных культур озимой пшеницы, вызываемые, действием отрицательной температуры
3.3.4.2. Влияние отрицательной температуры на интенсивность дыхания и вклад альтернативного цианидрезистентного пути у клеток суспензионной культуры сахарного тростника
3.2.5. Изменения содержания АФК в клетках суспензионных культур растений, вызываемые действием отрицательной температуры
3.2.5.1. Влияние отрицательной температуры на уровень АФК в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы
3.2.5.2. Влияние отрицательной температуры на уровень АФК в клетках суспензионной культуры сахарного тростника
3.2.6. Изменение электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках суспензионных культур растений под действием отрицательной температуры
3.2.6.1. Влияние отрицательной температуры на изменение электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы
3.2.6.1. Изменение электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках суспензионной культуры сахарного тростника под воздействием отрицательной температуры
3.2.7. Изучение выхода цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и деградации ДНК в клетках суспензионной культуры озимой пшеницы под действием отрицательной температуры
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Формирование механизмов низкотемпературной адаптации в суспензионной культуре клеток озимой пшеницы
4.2. Отрицательная температура вызывает гибель клеток с признаками ПКГ в суспензионных культурах озимой пшеницы и сахарного тростника
4.3. Особенности развития ПКГ у растений при действии низких температур
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

определить, являются ли уже идентифицированные семейства протеаз главными действующими ферментами ПКГ.
Предложено несколько возможных вариантов включения растительных каспазо-подобных активностей в процесс ПКГ. Первый основывается на сходствах между процессами ПКГ у растений и животных. Он предполагает, что процесс клеточной самодеструкции имеет общий наследственный механизм и включает выход цитохрома с и фрагментацию ДНК. Метакаспазы в этом сценарии вначале являлись главными кандидатами на роль компонентов-посредников механизма каспазо-подобной деградации клеточного содержимого вплоть до того момента, когда было установлено, что эти протеазы не имеют каспазо-подобной активности. Однако вопрос о возможной регуляторной роли этих ферментов все еще остается открытым (Vercammen et al., 2007; Bonneau et al., 2008).
Во втором сценарии основное внимание уделяется различиям в структуре и активностях ключевых ферментов, осуществляющих упорядоченную деградацию клетки. В этом случае предполагается, что в эволюционный процесс растительных и животных механизмов ПКГ для достижения одинаковых целей были вовлечены несвязанные друг с другом протеазы (Bonneau et al., 2008), и поэтому вполне вероятно, что в растительных клетках могут оперировать как пути, сходные с ПКГ у животных, так и отличные от нее.
1.1.З.2.4. Регуляция процесса ПКГ у животных и растений Активация каспаз как главных эффекторов ПКГ должна очень тщательно контролироваться, чтобы не допустить гибели функционально важных клеток. Существует целый ряд позитивных и негативных регуляторов этих ферментов, которые противостоят друг другу вплоть до наступления необратимой фазы гибели. У разных групп организмов сходные функции регулирования хода ПКГ могут выполнять разные белковые комплексы. Так, например, у позвоночных животных белок FLIP (англ.
«FLICE-inhibitory protein»; FLICE - англ. «FADD-like interleikin-ip-converting