Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков

• Автор: Никифорова, Анна Борисовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. НАДН ЦИТОХРОМ В5 РЕДУКТАЗА/ЦИТОХРОМ В
1.1. НАДН цитохром Ьг редуктаза
1.1.1. Биохимические, редокс-свойства
1.2. Цитохром Ьб
1.3. Функции системы цитохром 1)5 редуктазы/цитохрома Ь5 внешней мембраны
митохондрий: установленные, предполагаемые, артефактные
1.3.1. НАДН семидегидроаскорбат редуктазная активность
1.3.2. НАДН аквакобаламин редуктазная активность
1.3.3. Предполагаемые антиоксидантные и прооксидантные функции системы
цитохром Ьз редуктазы/цитохрома 65 внешней мембраны митохондрий
1.3.4. Участие СуЬ5Я-СуЪ5 ОМ системы в метаболизме стероидных гормонов и липидном обмене
1.4. Стресс-индуцированный «внешний путь окисления НАДН» и его возможные
функции
1.4.1. Модели функционирования «внешнего пути»
1.4.2. Би-трансмембранная модель
1.4.3. Предполагаемые функции «внешнего пути»
2. Потенциал зависимый анионный канал (АТ)АС 1)
2.1. Структура УБАС
2.2. Регуляция метаболизма митохондрий
3. «Тканеспецифичная» ротенон-чувствительная НАДН убихинон (цитохром с) РЕДУКТАЗА
4. Апоптоз ИНДУЦИРУЮЩИЙ ФАКТОР (АП7)
4.1. Экспрессия АП
4.2. Локализация АП
4.3. Структура АШ
4.4. Редокс-свойства/биохимические свойства
4.5. Физиологическая роль АП7 митохондриях

5. Методы регистрации активности НАДН-зависимых редуктаз ксенобиотиков
ВНЕШНИХ ОТДЕЛОВ МИТОХОНДРИЙ
6. Ксенобиотики, использованные в работе в качестве акцепторов
6.1. Менадион
6.2. Нитрофурантоин
6.3. Паракват
6.4. Доксорубицин
6.5. Даунорубицин
6.6. Арсеназо III
6.7. Люцигенин
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Культуры клеток
1.1. Выделение нейтрофилов из крови крыс
1.2. Выделение крысиных перитонеальных макрофагов
1.3. Выделение кардиомиоцитов крысы
1.4. Оценка цитотоксичности
2. Получение гомогенатов и срезов ткани, выделение митохондрий
2.1. Приготовление гомогенатов печени и почек крысы
2.2. Выделение интактных митохондрий из печени крыс
2.2.1. Моделирование повреждения митохондриальных мембран
2.2.2. Оценка количества повреждённых митохондрий после выделения
2.2.3. Определение количества белка
2.3. Приготовление тонких срезов мозга крысы
3. Измерение продукции активных форм кислорода
4. Методы оценки основных параметров, характеризующих функциональное состояние изолированных митохондрий
4.1. Измерение объёма митохондриального матрикса
4.2. Установка для одновременной регистрации изменений концентрации различных ионов в среде инкубации и скорости потребления кислорода митохондриями.
4.2.1. Измерение трансмембранного потенциала изолированных митохондрий
4.2.2. Измерение максимальной кальциевой емкости
4.2.3. Состояние системы окислительного фосфорилирования
4.3. Регистрация окисления пиридиннуклеотидов
5. Регистрация восстановления используемых акцепторов

5.1. Восстановление цитохромов с и
5.2. Восстановление ксенобиотиков
5.2.1. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в интактных и пермеабилизованных клетках
5.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии
5.2.3. Протокол для измерения НАДН люцигенин-редуктазной активности в гомогенатах тканей
6. Статистическая обработка
7. Материалы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Разработка методов оценки активности НАДН-зависимых редуктаз
КСЕНОБИОТИКОВ ВНЕШНИХ ОТДЕЛОВ МИТОХОНДРИЙ В МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ
1.1. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по окислению добавленного НАДН
1.2. Измерение активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по восстановлению люцигенина до диметилбиакридена
1.2.1. Анализ продукции ДБА НАД(Ф)Н оксидоредуктазами в пермебилизованных клетках НЕр-2 с помощью проточной цитометрии
1.2.2. Анализ сайтов продукции ДБА в клетках НЕр-2 с помощью флуоресцентной микроскопии
1.2.3. Визуализация сайтов с высокой НАДН оксидоредуктазной активностью на срезах мозга
1.2.4. Анализ активности НАДФН оксидаз плазматической мембраны макрофагов и нейтрофилов и гомогената почек
1.3. Регистрация активности НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий по генерации активных форм кислорода в присутствие автоокисляющихся акцепторов.
2. Роль НАДН ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ВНЕШНИХ ОТДЕЛОВ митохондрий в генерации АФК и индукции Са-зависимой неспецифической поры (мРТР)
2.1. Продукция АФК суспензией митохондрий при добавлении внешнего НАДН
2.2. Открытие поры в присутствии ксенобиотиков и внешнего НАДН
3. Идентификация НАДН-зависимой оксидоредуктазы, ответственной за активацию ксенобиотиков во внешних отделах митохондрий

субстрата (при восстановлении комплексом I дыхательной цепи), длина волны поглощения восстановленной формы цитохрома с совпадает с длиной волны, отражающей набухание митохондрий.
Для измерения НАДН оксидоредуктазной активности внешних отделов митохондрий необходимо подобрать акцептор, который не будет восстанавливаться другими митохондриальными дегидрогеназами и метод регистрации восстановленной формы должен не пересекаться с другими изменяющимися характеристиками. В настоящее время в литературе не описано акцептора для измерения активности систем во внешних отделах митохондрий, который бы отвечал необходимым требованиям.
Третьим подходом измерения активности НАДН оксидоредуктаз, является регистрация образования АФК. Активные НАДН оксидоредуктазы могут напрямую восстанавливать кислород и в условиях использования автоокисляющегося акцептора АФК можно регистрировать, как побочные продукты. В настоящее время существует много способов регистрации как супероксид-аниона, так и гидропероксида. Но, как и в случае подбора акцептора, необходимо наличие характеристики, позволяющей вычленять вклад НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий в детектируемое накопление АФК в субклеточных и клеточных моделях.
Таким образом, в настоящее время, существует несколько методов регистрации активности НАДН оксидоредуктаз, но ни один из них не адаптирован для исследования ферментных систем внешних отделов митохондрий. Для изучения и идентификации редуктаз ксенобиотиков необходимо разработать или усовершенствовать уже имеющиеся подходы регистрации активности похожих ферментов.
6. Ксенобиотики, использованные в работе в качестве акцепторов
В качестве модельных акцепторов для НАДН оксидоредуктаз внешних отделов митохондрий мы изучили семь лекарственных препаратов и ксенобиотиков, которые согласно литературным данным, описанным выше, активируются НАДН
оксидоредуктазами внешних отделов митохондрий.
6.1. Менадион
Полициклический ароматический кетон, основой которого является 1,4-нафтохинон. Менадиона натрия бисульфит
применяется в качестве лекарственного препарата как
синтетический водорастворимый аналог витамина К (торговое наименование этой соли — викасол).
Рис. 2. Меналион