Рекомбинантная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina: получение, свойства и перспективы применения

• Автор: Голотин, Василий Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 166 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1.1. Фосфатазы
1.2. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз
1.3. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз
1.4. Физико-химические и каталитические характеристики щелочных фосфатаз и их пространстфенная организация
1.4.1. Молекулярная масса (Мг) и изоэлектрическая точка (рГ)
1.4.2. Влияние значений pH и температуры
1.4.3. Влияние ингибиторов
1.4.4. Субстратная специфичность
1.5. Структурно-функциональные особенности щелочных фосфатаз
1.6. Структурно-функциональные особенности психрофильных щелочных фосфатаз морских бактерий
1.7. Практическое применение щелочных фосфатаз
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Реагенты и материалы, использованные в работе
2.2. Выделение геномной ДНК
2.3. Гель-электрофорез ДНК
2.4. Амплификация структурных генов белков
2.5. Рестрикция
2.6. Лигирование фрагментов ДНК в плазмиду

2.7. Подготовка компетентных клеток и трансформация E.coli
2.8. Выделение и секвенирование рекомбинантных плазмид
2.9. Получение мутантных генов
2.10. Гетерологическая экспрессия рекомбинантных генов в E. coli
2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.12. Анализ белковой фракции телец включения
2.13. Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.14. Определение концентрации белков
2.15. Определение активности ЩФ
2.16. Определение активности лектинов
2.17. Определение активности силикатеиноподобного катепсина и анализ наноструктур
2.18. Определение каталитических параметров СтАР
2.19. Определение рН-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность СтАР
2.20. Определение температурного оптимума и температурной стабильности, влияния ионов магния на температурную стабильность СтАР
2.21. Влияние ионов натрия и калия на активность СтАР
2.22. Изучение влияния ЭДТА и ДСН на активность и стабильность СтАР
2.23. Субстратная специфичность щелочной фосфатазы
2.24. Статистика
2.25. Атомно-адсорбционная спектроскопия
2.26. ЗО-Компьютерное моделирование пространственной структуры и молекулярный докинг
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Получение рекомбинантной щелочной фосфатазы СтАР
3.1.1. Получение плазмидных конструкций
3.1.2. Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии СтАР
3.1.3. Выделение и очистка рекомбинантной СтАР
3.2. Физико-химические свойства СтАР
3.2.1. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка
3.2.2. Оптимум pH, термостабильность и зависимость активности СтАР от присутствия ионов
3.2.3. Влияние ингибиторов
3.2.4. Субстратная специфичность
3.3. Каталитические параметры СтАР
3.4. Моделирование пространственной структуры СтАР
3.5. Сайт-направленный мутагенез СтАР
3.6. Перспективы применения рекомбинантной СтАР
3.6.1. Применение СтАР для дефосфорилирования векторов
3.6.2. Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина СтАРИоС
3.6.3. Получение гибридных бифункциональных белков на основе генов СтАР и лектинов
3.6.3.1. Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего лектина СтАР/ССР
3.6.3.2. Моделирование пространственной структуры гибрида С/иАР/СОЬ
3.6.3.3. Получение гибридного бифункционального маннан-связывающего лектина СтАР/МБР-АА
3.6.3.4. Моделирование пространственной структуры маннан-связывающего лектина и его гибридного аналога СтАР/МВР-АА

(Vallee, Auld, 1980). Кристаллографические исследования ЩФ E. coli показали нековалентное связывание фосфатата двумя атомами кислорода с гуанидиновой группой остатка аргинина Argl66, тогда как два других атома кислорода формируют фосфатный мостик между двумя атомами Znl и Zn2, Роль гуанидиновой группы остатков аргинина в активном центре ферментов нуклеинового обмена была отмечена еще на заре структурных исследований, когда смогли установить структуру комплекса нуклеазы (3.1.31.1) стафилококков со специфическим ингибитором (Мецлер, 1980). Было показано, что остаток Arg активного центра образует водородные связи с 5’-фосфатной группой, то есть является своего рода ловушкой для субстрата. Кроме того, положительные заряды гуанидиновой группы остатка аргинина сильно поляризуют фосфатную группу и благоприятствуют нуклеофильной атаке. Кроме того, Arg находится в положении, удобном для протонирования О" уходящей группы. Боковые группы остатка Arg могут образовывать до пяти водородных связей каждая и способны одновременно взаимодействовать с фосфатными группами субстрата и другими группами белковой молекулы, например, карбонильной. Таким образом, остаток Arg отвечает за образование сорбирующего участка для субстрата в активном центре молекулы фермента.
Рис. 4. Схема предполагаемого механизма действия щелочной фосфатазы.

V-'Ser1Q
Ч—Seriœ
0'V'-Ser1C