Геномная вариабельность возбудителей лекарственно-устойчивого туберкулеза, распространенных на территории Российской Федерации

• Автор: Шитиков, Егор Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 176 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Общая характеристика Mycobacterium tuberculosis
1.2 Особенности геномной организации М. tuberculosis
1.3 Эволюция микобактерий туберкулезного комплекса
1.4 Популяционная структура М. tuberculosis
1.5 Молекулярная эпидемиология туберкулеза в России
1.6 Генетическое семейство Beijing М. tuberculosis
1.7 Молекулярные основы возникновения устойчивости к противотуберкулезным препаратам
1.7.1 Механизм возникновения лекарственно-устойчивых штаммов
1.7.2 Формирование устойчивости к различным противотуберкулезным препаратам
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы
2.2 Геномные последовательности
2.3 Амплификация фрагментов геномаМ tuberculosis
2.4 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа
2.5 Реакция удлинения зонда и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции
2.6 Секвенирование фрагментов генома модифицированным методом Сенгера
2.7 VNTR-типирование
2.8 Полногеномное секвенирование
2.9 Анализ данных полногеномного секвенирования
2.10 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Формирование экспериментальных групп образцов ДНК штаммов М. tuberculosis
3.2 Формирование коллекции геномных последовательностей
3.3 Сполиготипирование штаммов М. tuberculosis
3.4 Считывание и первичный анализ геномных последовательностей отобранных эндемичных для России клинических изолятов М. tuberculosis
3.5 Сборка полных геномных последовательностей
3.5 Сравнительный филогенетический анализ секвенированных штаммов
3.6 Определение генотип-специфических мутаций
3.7 Валидация генотип-специфических SNPs
3.8 Характеристика кластера Beijing B0/W
3.8.1 Beijing B0/W148 кластер-специфические SNPs
3.8.2 Структурная организация генома Beijing B0/W
3.9 Анализ генетических маркеров, ассоциированных с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis
3.10 Построение гипотез формирования устойчивости к противотуберкулезным препаратам
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Формирование экспериментальных групп образцов ДНК штаммов М. tuberculosis
4.2 Сполиготипирование штаммов М. tuberculosis
4.3 Считывание и анализ геномных последовательностей отобранных изолятовМ tuberculosis
4.4 Сравнительный филогенетический анализ секвенированных штаммов
4.5 Определение и валидация генотип-специфических мутаций
4.6 Характеристика кластера Beijing B0/W
4.7 Анализ генетических маркеров, ассоциированных с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis
4.8 Построение гипотез формирования устойчивости к
противотуберкулезным препаратам
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список используемых сокращений
Список литературы
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования
В настоящее время туберкулез остается одной из наиболее значимых проблем здравоохранения во всем мире. По оценке Всемирной организации здравоохранения Россия является одной из 22 стран мира с наибольшим бременем данного заболевания. В стране регистрируется более трети всех новых случаев туберкулеза, выявленных в Европейском регионе, причем смертность превышает показатели стран Европы в 5 - 8 раз (WHO, 2012).
Инфекционным агентом, вызывающим данное заболевание, является микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Использование современных молекулярно-генетических методов типирования, таких как IS6110 RFLP-анализ (от англ. Restriction Fragment Length Polymorphisms IS6110, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов IS6110) (van Embden et al., 1993), сполиготипирование (Kamerbeek et al., 1997) и VNTR-анализ (от англ.УапаЫе Number of Tandem Repeats, анализ числа тандемных повторов в различных локусах генома) (Supply et al., 2006) позволило определить структуру популяции возбудителя туберкулеза в России. Согласно многочисленным исследованиям на территории страны превалируют изоляты сполиготипов Beijing, Ural и LAM (Mokrousov et al., 2003; Kovalev et al., 2005; Dymova et al., 2011). При этом доля генотипа Beijing в зависимости от региона может достигать 80 %, а относящиеся к нему представители демонстрируют повышенную вирулентность, способность размножаться в макрофагах и быструю адаптацию к иммунной системе макроорганизма (Mokrousov, 2013). В настоящее время так же показана ассоциация сполиготипа Beijing с повышенной лекарственной устойчивостью, обусловленной точечными мутациями в геноме (Hanekom et al., 2011). При этом следует отметить, что в России все чаще выявляются изоляты различных семейств М. tuberculosis с так называемой множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые, как минимум, к

уровень устойчивости к антибиотикам генотипа Beijing с множественной лекарственной устойчивостью отсутствие ответа на противотуберкулезную терапию
Повышенная вирулентность Быстрое распространение патогена, уменьшенная выживаемость (на животных моделях) Быстрая прогрессия заболевания, высокая бактериальная нагрузка
Высокая иммуногенность Повышенный ответ провоспалительных цитокинов; некроз зараженных макрофагов Образование большого количества каверн, большое количество бактерий в мокроте
Адаптация (коэволюция) к иммунной системе человека Ассоциация туберкулеза, вызванного штаммами генотипа Beijing, с полиморфизмами в TLR2 и SLC11А1 во Вьетнаме и Индонезии, соответственно Повышенная активность течения болезни
1.7 Молекулярные основы возникновения устойчивости к противотуберкулезным препаратам
В последние годы во многих странах мира наблюдается повсеместное распространение лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis. Согласно классификации ВОЗ резистентные штаммы делятся на четыре группы: монорезистентные (устойчивые к одному из противотуберкулезных препаратов), полирезистентные (устойчивые к двум и более противотуберкулезным препаратам, но не к рифампицину и изониазиду одновременно), штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ - устойчивые, как минимум, к рифампицину и изониазиду) и штаммы с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ - устойчивые к изониазиду и рифампицину, одному из фторхинолонов, и, по крайней мере, к одному из