Изучение влияния мутаций в белке PsbO на активность водоокисляющего комплекса в Chlamydomonas reinhardtii

• Автор: Пиголев, Алексей Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 104 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структурно-функциональная организация фотосистемы
1.2. Внешние белки водоокисляющего комплекса фотосистемы
1.3. Белок РэЬО
1.3.1. Общая характеристика
1.3.2. Первичная структура РвЬО
1.3.3. Структура РвЮ, связанного с фотосистемой
1.3.4. Связывание РвЬО с фотосистемой
1.4. Функциональная роль РьЬО
1.4.1. Функционирование фотосистемы 2 в отсутствие РвЬО
1.4.2. ЛрБЬО мутации
1.4.3. Взаимодействие РвЬО с ионами
1.4.3.1. РзЬО и марганец
1.4.3.2. Кальций
1.4.3.3. Ионы хлора
1.4.4. Участие РзЬО в транспорте воды и протонов
1.4.5. Возможная роль РбЬО в регуляции переходов димер/мономер
комплексов фотосистемы
1.4.6. ГТФазная активность РвЬО
1.5. Сайт-направленный мутагенез РэЬО
1.6. Общая характеристика С. гетИагДп
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Реактивы, среды, антибиотики
2.2. Методы
2.2.1. Условия выращивания С. геткагДН
2.2.2. Определение содержания хлорофилла и каротиноидов в клетках С.гетНагЛИ
2.2.3. Измерение скорости выделения кислорода
2.2.4. Измерение флуоресценции хлорофилла
2.2.5. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК

2.2.6. Электрофорез ДІ1К в агарозном геле
2.2.7. Выделение геномной ДНК для ПЦР-анализа
2.2.8. ПЦР-анализ геномной ДНК С. геіпкагскіі на наличие маркерного гена .
2.2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.2.10. Иммуноблоттинг
2.2.11 .Выделение тилакоидных мембран и частиц ФС-
из клеток С. гетИагЛіі
2.2.12. Трансформация клеток С. геіпкагЛіі
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Функциональная характеристика и биогенез комплекса ФС-
в клетках АрэЬО мутанта СЫатуАотопах геіпкагскіі
3.1.1. Особенности роста культур клеток дикого типа и АряЪО штамма С.геіпкагскіі
3.1.2. Концентрация пигментов в клетках
3.1.3. Фотосинтетическое выделение кислорода
3.1.4. Анализ полипептидного состава пигмент-белковых комплексов тилакоидных мембран хлоропластов
3.1.5. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции
хлорофилла ФС-
3.1.6. Общая характеристика ФС-2 в клетках Ар.чЬО С.геіпкагсіїіі
3.2. Влияние замен К223Е и К226Е в белке РвЬО на стабильность
и функциональную активность ВОК фотосистемы 2 в клетках С. геіпкагскіі .
3.2.1. Выбор участка в структуре белка РьЬО для внесения аминокислотных замещений
3.2.2. Получение штаммов С.геіпИагсІШ с мутациями К223Е и К226Е
в белке РэЬО водоокисляющего комплекса ФС-
3.2.3. Функциональная характеристика мутанта К226Е С.гетИагскИ
3.2.4. Функциональная характеристика мутанта К223Е С.геіпкагЛіі
3.2.4.1. Исследование процессов фотоинактивации на клетках
и препаратах ФС-2 из К223Е мутанта С.геіпкагскіі
3.2.4.2. Влияние ионов Са2+ на фотохимическую активность ФС-
3.2.4.3. Влияние доноров электронов на кинетику работы ВОК
3.3. Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВОК водоокисляющий комплекс
ДБМИБ 2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-р-бензохинон (ОВМ1В), ингибитор активности Ь(/(комплекса
ДХБХ 2,6-дихлор-/?-бензохинон (ОСВР), акцептор электронов
ГТФ гу аноз и н-5 ^триф ос ф ат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ик инфракрасный
нм нанометр
кДа килодальтон
ПААГ полиакриламидный гель
п.н. пара нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
РЦ фотохимический реакционный центр
сск светособирающий комплекс
ТМФД К’,Ы’-гетра мети л-р-фенилендиамин (ТМРО), донор электронов
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
Фсо феофитин
ФС-1 фотосистема
ФС-2 фотосистема
Хл хлорофилл
ЭДТА этилендиаминтстрауксусная кислота
этц электрон-транспортная цепь
Ар ампициллин
ВВУ фрагменты тилакоидных мембран, обогащённые фотосистемой 2 (выделенные согласно [ВегДюЫ Щ а1., 1981])
осми диурон, ингибитор электронного транспорта в ФС-
ОТТ дитиотреитол
Е0/ стандартный редокс потенциал при pH 7,
Ро начальный («темновой») уровень флуоресценции хлорофилла а
Рт максимальный уровень флуоресценции хлорофилла а
К223Е мутант С.геЫшгЖИ по белку РзЬО с заменой лизина (223) на глутаминовую кислоту
К226Е мутант С.геткапкИ по белку РэЬО с заменой лизина (226) на глутаминовую кислоту
кт константа Михаэлиса-Ментен
Рб80 первичный донор электрона в фотосистеме
Раг паромомицин
РвЬО марганецстабилизирующий белок, МСБ
Ол И Ов первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона в фотосистеме
БББ додецилсульфат натрия
Уг аминокислотный остаток тирозина 161 белка О! в фотосистеме

Глава 1. Обзор литературы
Следует также отметить, что между белковым составом ВОК цианобактерий и растений существует значительные отличия, поэтому переносить результаты, полученные на цианобактериях, на растения не совсем корректно [De Las Rivas et al., 2004]. В связи с этим особый интерес представляет работа с использованием эукариотических модельных организмов со сходным белковым составом.
Исследования на высших растениях осложняются тем фактом, что ApsbO мутант у них нежизнеспособен, и кроме того, мутации в белке делают ФС-2 чувствительной к фотоинактивации [Yi et al., 2005]. Поэтому вплоть до недавнего времени не существовало мутантов высших растений по белку PsbO, что было связано еще и с отсутствием метода, позволяющего целенаправленно инактивировать гены в ядерном геноме растений. Однако в настоящее время уже могут быть получены Т-ДНК мутанты арабидопсиса практически по любому гену [Tani et al., 2004; Hirayama and Shinozaki, 2010; O'Malley and Ecker, 2010]. Кроме того, подавить экспрессию генов сейчас возможно используя методику RNAi-сайленсинга [Manuell and Mayfield, 2006; Ali et al., 2010; Cerutti et al., 2011; Castel and Martienssen, 2013]. Применение этих технологий позволило изучить роль двух изоформ белка PsbO у арабидопсиса. В клетках A.thaliana два гена кодируют белок PsbO. Новая форма белка PsbO-2 возникла сравнительно недавно в ходе эволюции, появившись в результате дупликации гена. Аминокислотная последовательность двух белков отличается только на 11 аминокислотных остатков, однако у каждой из этих изоформ есть собственная уникальная функция, и они не могут полностью заменить друг друга [Murakami et al., 2002; Murakami et al., 2005]. С помощью RNAi интерференции можно подавить как синтез двух изоформ сразу, так и каждой по отдельности. Подавление экспрессии сразу двух белков (и PsbO-1 и PsbO-2) приводило к значительным нарушениям в ФС-2 и растения не могли расти в фотоавтотрофных условиях [Yi et al., 2005]. Выключение одного из двух генов по отдельности также приводило к развитию вполне определенного фенотипа, что подтверждает идею о специализации каждого варианта белка. Основной изоформой белка является PsbO-1 [Murakami et al., 2005; Bricker and Frankel, 2008]. Именно она имеет отношение к функционированию ФС-2, тогда как PsbO-2 служит для других функций. В частности, одно из предположений связано с тем, что PsbO-2 участвует в дефосфорилировании белка D1 и функционирует как ГТФаза [Lundin et al., 2007]. Исследователями было продемонстрировано, что уровень экспрессии белков PsbO-1 и PsbO-2 по-разному изменяется в ходе Холодовой акклиматизации растений. В ходе обработки растений холодом содержание основной формы PsbO-1 снижалось, а уровень PsbO-2 возрастал [Goulas et al., 2006].