Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови

• Автор: Торопыгин, Илья Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна работы
1.4 Практическая значимость работы
1.5. Положения, выносимые на зашщу
1.6. Публикации и апробация работы
1.7. Объем и структура работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Использование масс-спектрометрии при изучении белков
2.2. Основы МАЫЛ-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов.
2.2.1. Устройство масс-спектрометра
2.2.2. Образование свободных ионов в МА1Ю
2.2.3. Измерение масс ионов
2.2.4. Влияние изотопии
2.2.5. Времяпролетный масс-анализатор
2.2.6 Принцип действия времяпролетного масс-анализатора
2.2.7. Основные параметры масс-анализаторов
2.2.9. Фрагментация пептидов в МАЫ
2.2.10. Измерение т/г фрагментов
2.2.11. Детектор времяпролетного анализатора
2.3. Масс-спектрометрия в биологии и медицине
2.3.1. Протеомное профилирование образцов
2.3.2. Профилирование для медициской диагностики
2.4. Ингибиторы протеаз в плазме крови
2.4.1. Механизмы действия ингибиторов протеиназ
2.4.2. Стандартный механизм действия ингибиторов сер иновых протеиназ
2.4.3. Отклонения от стандартной модели действия ингибитора
2.4.4. Альфа 2-Макроглобулин
2.5. Ренин-аншотензиновая система
2.5.1. Ангиотензинпревращаюшдй фермент
2.6. Амилоцц-бета и болезнь Альцгеймера
2.6.1. Ангиотензинпревращающий фермент в метаболизме амилоида-бета
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Клинический материал
3.2. Пептиды и белки
3.4. Гидролиз пептидов амилоида бета отдельными доменами АПФ
3.5. Количественные измерения продуктов гидролиза пептидов амилоида-бета.

3.6. Получение фрагмента Ab(l-5), меченного
3.7. Гидролиз сывороток трипсином
3.8. Гидролиз сывороток в присутствии рекомбинантного SAA (rSAA)
3.9. Количественные MALDI-TOF анализы SAA
4.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Гидролиз пептида АЬ (1-16)
4.1.1. Гидролиз пептида АЬ (1-16) ангиотензинпревращающим ферментом и влияние изомеризации Asp7 на скорость гидролиза
4.1.2. Сравнение скоростей гидролиза изомеров пептидов АЬ АПФ с использованием количественной масс-спектрометрии с меченными 180 внутренними стандартами
4.2. Измерение активности протеаз в плазме и сыворотке крови
4.2.1. Исследование особенностей ингибирования сывороткой экзогенного трипсина при различных количествах вводимого фермента с исследованием путем масс-спектрометрии MALDI-TOF полученных пептидных продуктов .
4.2.1. Избирательный протеолиз в сыворотке крови трипсином
4.2.2. Трипсинолизрекомбинантного SAA(rSAA) в сыворотке больной аденокарциномой (№411) и миомой (№417)
4.2.3. Сравнение степеней необратимого ингибирования трипсина в сыворотках больных аденокарциномой яичника (№411 и №431) и миомой матки (№417)
4.2.4. Диагностическая классификация образцов рака яичника и нераковых образцов
5. ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТЬ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Сокращения

1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
Протеазы, или протеолитические ферменты катализируют гидролиз белков по пептидным связям. Биоинформационный анализ генома человека, показал, что к протеазам и гомологичным им белкам относится 566 генов, или 1,7% генома.
До недавнего времени протеазы рассматривались как ферменты, конвертирующие неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, включая ферменты и гормоны, в активное состояние. Однако в настоящее время стало очевидным, что перечень физиологических функций протеаз значительно шире. Протеазы выполняют важную роль во многих процессах и задействованы не только в метаболических, но и в сигнальных молекулярных сетях. В силу физиологической значимости протеазы играют важную роль и в патогенезе различных заболеваний, а значит, являются привлекательным диагностическими и лекарственными мишенями.
Чтобы наиболее полно понимать функциональное значение протеаз в тех или иных процессах, необходимо определить специфичность фермента, идентифицировать эндогенные субстраты и продукты гидролиза, а также активаторы и ингибиторы фермента. Для описания и моделирования молекулярных сетей, в которых задействованы протеазы, также необходимы количественные оценки концентраций и активностей ферментов, в том числе in vitro, ex vivo и in vivo.
В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на масс -спектрометрии MALDI-TOF - лазерной десорбции/ионизации из объема специального вещества - матрицы, с времяпролетным детектором. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого образца или молекулярных масс компонентов сложных смесей.

неспособностью некоторых пептидов к ионизации, стерическими ограничениями при гидролизе или особенностями специфичности протеаз, а также природными и инструментальными модификациями белков и пептидов.
Как правило, идентификация белка с использованием пептидных карт возможна только в случае индивидуального белка или несложных смесей из двух-трех, редко четырех белков. Самыми эффективными способами разделения являются одномерный или двумерный, по О’Фареллу [41] электрофорез в геле. Гидролиз выделенного белка чаще всего проводят непосредственно в геле, после чего пептидные продукты легко экстрагируются и используются для масс-спектрометрического анализа. Для такого анализа достаточно нескольких кубических миллиметров геля, содержащего около 20-100 нг белка [42].
Поставляемые в последние годы масс-спектрометры позволяют не только измерять молекулярные массы целых ионов пептидов, но и получать спектры (их часто называют тандемными) фрагментов отдельных пептидов в сложных смесях, например, в смесях продуктов гидролиза белков. Такие спектры иногда позволяют расшифровать неизвестную аминокислотную последовательность пептида. Если это невозможно, например, в случае неполной фрагментации конкретного пептида, полученный спектр фрагментации можно использовать для поиска в базах данных пептида, который мог бы иметь спектр фрагментации аналогичный экспериментальному. Наличие спектров фрагментации двух и более пептидов одного белка позволяет идентифицировать белок с высокой достоверностью. Это дает возможность проведения высокопроизводительного анализа сложных смесей белков путем проведения на первом этапе гидролиза смеси без предварительного разделения компонентов, с последующим разделением продуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-