Идентификация аминокислот активного центра транспортеров органических катионов (ОСТs), участвующих в связывании кортикостерона

• Автор: Шацкая, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Вюрцбург
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Цель работы
1. Обзор литературы
1.1 Транспортеры семейства Э1-С22
1.2 Функциональные характеристики транспортеров ОСТ
1.3 Субстратные свойства транспортеров ОСТ
1.4 Клеточная локализация субтипов ОСТ
1.5 Полиморфизм и мутации транспортеров ОСТ
1.6 Клиническая значимость транспортеров ОСТ
2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Радиоактивные соединения
2.1.3 Ферменты и наборы
2.1.4 Оборудование
2.2 Молекулярно биологические методы
2.2.1 Приготовление плазмид дикого типа, точечных мутантов и химерных конструктов
2.2.2 Линеаризация плазмидной ДНК
2.2.3 Спектрофотометрический анализ ДНК
2.2.4 Электрофорез ДНК
2.2.5 Транскрипция мРНК с матрицы ДНК
2.2.6 Электрофорез РНК
2.3 Система экспрессии в ооцитах лягушки Хепорив 1_аеуіз
2.3.1 Лапоротомия Хепоріт Лаеуіз
2.3.2 Приготовление ооцитов для инъекций
2.3.3 Стадии развития ооцитов
2.3.4 Микроинъекции РНК в ооциты
2.3.5 Измерение транспорта
2.3.6 Расчеты и статистика

3. Результаты
3.1 Функциональная характеристика химер, созданных на базе транспортера гОСТ1 с заменой фрагментов на соответствующие из ЮСТ2

3.2 Анализ активности химер
3.3 Измерение значений Км для ТЕА
3.4 Взаимодействие кортикостерона с конструктами с точечными мутациями на базе транспортера гОСТ1
3.5 Взаимодействие катионных субстратов с мутантами гОСТ 1, имеющими высокое сродство к кортикостерону
3.6 Ингибирование кортикостероном мутантов на базе ЮСТ2, содержащих единичные замены аминокублот из ЮСТ1
4. Обсуждение
5. Литература

Список сокращений.
Аденозинтрифосфорная кислота Бычий сывороточный альбумин
N, N-бис [2-гидроксиэтил]-2-аминоэтансульфоновая кислота (counts per minute) количество импульсов в минуту Кюри
(C-terminus) С-конец Диэтилпирокарбонат Диметилсульфоксид (extracellular loop) внеклеточная петля
(Flounder organic cation transporter) транспортер органических катионов камбалы
hOCT (Human organic cation transporter) транспортер органических
катионов человека
1С5о (half maximal inhibitory concentration), концентрация ингибитора, при которой активность белка составляет 50 % от исходной |-Loop (Internal loop) внутриклеточная петля
MFS (Major facilitator superfamily) Основное надсемейство транспортеров
МРР 1-Метил-4-фенилпиридин йодид
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
mOCT (Mouse organic cation transporter) транспортер органических
катионов мыши
NMN N-1-метилникотинамид
N-Term (N-terminus) N-конец
OAT (Organic anion transporter) транспортер органических анионов
OCT (Organic cation transporter) транспортер органических катионов
OCTN (Organic cation-carnitine transporter) транспортер органических
катионов и карнитина
РАН Парааминогиппуровая кислота
ПЦР Полимеразная цепная реакция
ЮСТ (Rat organic cation transporter) транспортер органических катионов
крысы
SDS Додецил сульфат натрия

С-Тегт
DEPC
DMSO
E-Loop

2.2.2 Линеаризация плазмидной ДНК.
Плазмидная ДНК - Юмкг (гОСТ1, ЮСТ2, химеры, мутанты, они все клонированы в вектор pRSSP) были обработаны 15 ед. рестриктазы Mlu I в 50 мкл R+ буфера (содержащего 10 мМ Tris-HCI pH 8.5, 10 мМ MgCI2, 100 мМ KCI, 0,1 мг/мл В SA), ночь при 37°С. Степень рестрикции ДНК контролировали с помощью агарозного электрофореза, для чего аликвоту из реакционной смеси наносили на форез. После рестрикции, ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1 по объему), после добавления пробирку перемешивали около 20 сек. С последующим
центрифугированием в течении 30 сек., при комнатной температуре при 10000g. Супернатант отбирали и преципитировали ДНК добавлением 3 объемов спирта и 1/10 объема ацетата натрия pH 5,0 [Wallace D, 1987]. Смесь перемешивали 20 сек и охлаждали на -20° С в течении минимум 45 минут. После этого ДНК осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 4° С на 10000g. Супернатант убирали и осадок промывали 500 мкл охлажденного 70% этанола с последующим центрифугированием в течении 10 минут при 4° С, 10000g. Осадок ДНК сушили на воздухе и растворяли в 10 мкл воды. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.
2.2.3 Спектрофотометрический анализ ДНК.
Концентрацию ДНК вычисляли по оптической плотности. Чистоту ДНК определяли по соотношению между поглощением на 260 нм и 280 нм. Соотношение должно быть около 1.8 - 2.0 для препарата, не содержащего белковых примесеи. Также возможно значение 1.5; но если оно ниже, то это означает загрязненность
образца примесями белка.
2.2.4 Электрофорез ДНК.
После расщепления рестриктазой Mlu I продукты анализировались в 1% агарозном геле, в буфере ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) с 0,1 мг/мл этидия бромида. Образцы содержали по 0,5 мкл реакционной смеси (0,1 мкг ДНК) которая разбавлялась в 3 мкл воды и 1 мкл буфера для нанесения (30% глицерин,