Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов

• Автор: Тимофеева, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 186 с. : ил.

Содержание
Список сокращении
Введение
1. Взаимодействие АР-эндонуклсазы человека АРЕ1 с ДНК (Обзор литературы)
1.1. Связывание субстрата, содержащего АР-сайт
1.1.1. Влияние ионов Mg2+ на связывание АРЕ1 с ДНК
1.1.2. Особенности взаимодействия АРЕ1 с субстратом и продуктом
1.1.3. Определение потенциальных контактов АРЕ1 с ДНК, содержащей АР-сайт
1.1.4. Стехиометрия связывания АРЕ 1 с ДНК
1.1.5. Механизм поиска АР-сайта
1.2. Исследование кинетики взаимодействия АРЕ1 с АР-сайтом и его аналогами в стационарных условиях
1.2.1. Влияние локальной структуры ДНК-субстратов, содержащих АР-сайт или его аналоги
1.2.2. Особенности узнавания АР-сайта ферментом АРЕ1
1.3. Проявление АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к альтернативным субстратам
1.3.1. АР-сайты в одноцепочечной ДНК. Регуляция активности АРЕ1
концентрациями ионов Mg2+ и К* и репликативным белком A (RPA)
1.3.2. АР-сайты в нуклеиновых кислотах сложной структуры: частично двуцепочечной ДНК, вилкоподобной ДНК, ДНК с расплетенньш участком двойной спирали, ДНК/РНК-гибридах, псевдотриплексных
структурах, одноцепочечной РНК. Влияние АТР и
последовательности субстрата на активность фермента
1.4. Выявление аминокислотных остатков АРЕ1, участвующих в
узнавании и превращении АР-сайта
1.4.1. Роль остатка Asn212 в узнавании субстрата
1.4.2. Роль остатка Asp219 в узнавании субстрата. Влияние остатков Asp219 и Glu96 на каталитическую активность
1.4.3. Внутреннее подавление мутации Е96А второй мутацией K98R
1.4.4. Роль остатков Asp308, Asp283 и His309

1.4.5. Роль остатка Asp210 в эндопуклеазной активности
1.4.6. Роль остатков Glu96, Asp210, His309 и Cys65
1.4.7. Замены аминокислотных остатков, проникающих в спираль ДНК
1.4.8. Влияние контактов с сахарофосфатным остовом с 3'- стороны от AP-сайта на эффективность связывания субстрата и продукта
1.4.9. Влияние мутаций в петле а8 АРЕ1 на эффективность связывания субстрата и каталитическую активность
1.4.10. Делеция 33-х аминокислотных остатков с N-конца АРЕ1
1.4.11. Необычная роль остатка Cys99
1.4.12. Роль остатков Туг128, Туг171 и Туг269 в катализе
1.5. Кинетические исследования АРЕ1 в предстационарных условиях
1.5.1. Предстационарная кинетика взаимодействия с аналогом АР-сайта
1.5.2. Конформационные переходы в АРЕ1 и его мутантной форме
АРЕ1Y171F-P173L-N174К в процессе репарации АР-сайта
1.6. Участие АРЕ1 в процессе инцизиопной репарации нуклеотидов (NIR)
1.6.1. 3,N*-öeH3jmeHO-(lC - субстрат АРЕ1 в процессе NIR
1.6.2. Оптимальные условия для проявления активности NIR белком АРЕ1. Конформационные изменения АРЕ1, индуцированные
ионами Mg2*
1.6.3. Кинетические параметры и специфичность к основаниям
в процессе NIR
1.6.4. Основные продукты окисления цитозина - субстраты АРЕ1 в процессе NIR
1.6.5. Роль окислительно-восстановительного домена АРЕ1 в процессе

1.6.6. Роль остатков Lys98, Asp308 и Argl85 в процессах BER и NIR
1.7. Заключение по обзору
2. Материалы и методы

3. Изучение кинетического механизма процесса инцизионной репарации нуклеотидов, протекающего под действием апуриновой/аппримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1. Сравнение с процессом эксцизионной репарации оснований (Результаты)
3.1. Сродство АРЕ1 к DHU-субстрату и продуктам ферментативного разрезания субстратов DHU/G и F/G. Влияние мутаций К98А и 1ЧД61 на стабильность комплексов фермента с продуктами
3.2. Ферментативное разрезание [32Р]-меченых субстратов
3.3. Определение активности АРЕ1
3.4. Изменение интенсивности флуоресценции 2-амииопурина, введённого в DHU-содержащие субстраты, в ходе взаимодействия АРЕ1 с этими субстратами
3.5. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с неповреждённым лигандом
3.6. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с субстратом, содержащим DHU
3.7. Кинетический механизм АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов.
3.8. Кинетические изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с F- и АР-субсгратами
4. Обсуждение полученных результатов
4.1. Кинетические различия стадий связывания при специфических и нсспецифичсских взаимодействиях АРЕ1 с ДНК-субстратами
4.2. Особенности взаимодействия АРЕ1 с субстратами, содержащими DHU и АР-сайт
4.3. Влияние замены лизииа-98 на аланин на кинетические характеристики процессов, катализируемых АРЕ1
4.3.1. Взаимодействие АРЕ1К98А с неповреждённым лигандом
4.3.2. Взаимодействие АРЕ1К98А со специфическими субстратами, содержащими F и АР, в условиях BER
4.3.3. Взаимодействие АРЕ1К98А со специфическим субстратом, содержащим DIIU, в условиях NIR
Поскольку гидролиз фосфодиэфирной связи субстрата ферментом АРЕ1 происходит непосредственно с 5'-стороны от АР-сайта [75], авторы работы [74] проверяли влияние замены этого фосфата на остаток фосфоротиоата на активность АРЕ1 (Рис. 9). АРЕ1 активно расщепляет дуплекс с Ир-фосфоротиоатом со скоростью, приблизительно равной 1/20 от скорости расщепления Е-субстрата с традиционным фосфодиэфиром. Расщепление соответствующего 8р-изомера не было обнаружено; рассчитанная скорость расщепления для Бр-нзомера была <10-4 от той, что была найдена для Е-субстрата. Авторы сочли, что наиболее простым объяснением серьёзного влияния 5'-фосфоротиоатов на расщепление белком АРЕ1 является тот факт, что этот фосфат стереоспецифично атакуется ферментом во время расщепления [54].
Кроме того было показано [74], что неправильно спаренное основание, расположенное непосредственно с 5'-стороны от остатка Е, уменьшает скорость расщепления субстрата ферментом АРЕ1 в 4 раза по сравнению с Е-субстратом в полностью спаренном дуплексе. Соседнее 5'-неправильно спаренное основание имело даже более выраженный эффект на Е и Р-сайты, уменьшая расщепляющую активность АРЕ1 примерно в 100 раз. Напротив, неправильно спаренное основание с З'-сторопы имело лишь незначительное влияние на скорость расщепления любого из субстратов. Неправильно спаренные основания с обеих 5'- и З'-сторон от остатка Е имели даже больший ингибирующий эффект на эндонуклеазную активность АРЕ1, чем 5-неправильно спаренное основание само по себе (Таблица 4). Таким образом, как и предполагал Вайсе [76], наличие правильной двуспиральной структуры с 5'-стороны от АР-сайта намного более важно, чем с З'-стороны.
Таблица 4. Влияние фланкирующих неправильно спаренных оснований на активность АРЕ1 [74].
Контакт ДНК* Относительная эндонуклеазная активность, %
Е Р Е
5'-СХТ-3' вСА
5'-СХТ-3' ССА 1,1 ±0,7 1,3±0,1 24±2
5'-СХТ-3' ест 73±4 75±7 125±2
5'-СХТ-3’ ССТ 1,1 ±0,7 1,0±0,5 9±1
*Х соответствует Е, Р или Е.