Молекулярное моделирование взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами на примере формиатдегидрогеназы и поли(ADP-рибозо)-полимеразы

• Автор: Нилов, Дмитрий Константинович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
Введение
Литературный обзор
1.1 Строение и механизм изучаемых ферментов
1.1.1 Строение и механизм формиатдегидрогеназы
1.1.2 Строение и механизм поли(АОР-рибозо)-полимеразы
1.2 Методы молекулярного моделирования
1.2.1 Метод молекулярного докинга
1.2.2 Метод молекулярной динамики
1.2.3 Гибридные QM/MM расчеты
1.2.4 Минимизация энергии
1.2.5 Силовое поле и пакет программ Amber
1.2.6 Параметризация молекул
Экспериментальная часть
2.1 Пакеты программ, использованные в работе
2.2 Параметризация лигандов
2.3 Молекулярно-динамические симуляции
2.3.1 Подготовка стартовых моделей ферментов
2.3.2 Протокол молекулярно-динамических симуляций
2.3.3 Управляемая молекулярная динамика
2.3.4 QM/MM симуляция
2.4 Молекулярный докинг
2.5 Измерение ферментативной активности
Результаты и обсуждение
3.1 Моделирование формиатдегидрогеназы
3.1.1 Особенности открытой и закрытой конформации
3.1.2 Комплекс Михаэлиса
3.1.3 Транспорт через субстратный канал
3.1.4. Расчет каталитической константы
3.1.5. Заключение
3.2 Моделирование поли(АОР-рибозо)-полимеразы
3.2.1 Конструирование фермент-субстратных комплексов
3.2.2 Докинг известных ингибиторов
3.2.3 Скрининг коммерческой библиотеки
3.2.4 Скрининг специализированной библиотеки
3.2.5. Заключение
Основные результаты и выводы
Благодарности
Приложение
Приложение
Список литературы
Список сокращений

ПАР поли(АОР-рибоза)
ПАРП поли(АОР-рибозо)-полимераза
ПЛРП-CF С-концевой фрагмент поли(АВР-рибозо)-полимеразы
ФДГ формиатдегидрогеназа
ADP аденозиндифосфат
AG свободная энергия связывания
A G* свободная энергия активации
HF Метод Хартри-Фока
IC50 концентрация ингибитора, уменьшающая активность фермента на 50%
К, константа ингибирования
Кт константа Михаэлиса
мм молекулярно-механический
МР2 Метод Меллера-Плессе второго порядка
NAD+ никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма
NADH никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма
Рdock вероятность успешного локирования
PDB Protein Data Bank, база данных белковых структур
QM квантово-механический
RMSd среднее квадратичное отклонение
Введение
Термин «молекулярное моделирование» является общим названием для теоретических и вычислительных методов химии, биологии и наук о материалах, направленных на воспроизведение, симуляцию поведения молекул. Молекулярное моделирование упрощает изучение системы, описывая ее на атомном уровне с использованием законов классической физики. Такой подход дает возможность симулировать поведение систем, включающих тысячи атомов, и широко используется для изучения биологических макромолекул. Настоящая работа сфокусирована па применении методов молекулярного моделирования в биокатализе для изучения взаимодействий фермента с низкомолекулярными веществами — субстратами и ингибиторами. Рассматривается стохастический метод молекулярного докинга, обеспечивающий быстрый поиск возможных статичных конформаций субстрата или ингибитора в активном центре, и метод молекулярной динамики, позволяющий проследить эволюцию фермент-субстратного или фермент-ингибиторного комплекса во времени. В качестве объектов исследования были выбраны важные с точки зрения фундаментальной энзимологии ферменты формиатдегидрогеназа (ФДГ) и поли(АОР-рибозо)-полимераза (ПАРП). ФДГ представляет собой удобный объект для изучения механизма переноса гидрид-иона в активном центре NAD -зависимых дегидрогеназ методами вычислительной химии. Фермент используется также на практике для регенерации коферментов в процессах ферментативного синтеза оптически активных соединений, и разработка эффективных биокатализаторов на основе ФДГ по-прежнему актуальна. Биологическая роль ПАРП человека заключается в репарации ДНК, регуляции концентрации NAD+ и активации генов, ответственных за воспалительную реакцию. Фармакологическое ингибирование ПАРП может повышать эффективность действия противоопухолевых препаратов, препятствовать клеточному некрозу и подавлять различные воспалительные процессы. На данный момент известен ряд ингибиторов ПАРП, однако их фармакокинетические и токсичные свойства недостаточно изучены. Целью настоящей работы явилось использование методов молекулярного моделирования для решения следующих задач: изучения механизма образования фермент-субстратного комплекса ФДГ и разработки процедуры поиска новых ингибиторов ПАРП.
Экспериментальная часть.

граничных условий. Для расчета электростатических взаимодействий применяли метод PME (Particle Mesh Ewald). Радиус обрезки несвязных взаимодействий составлял 10 Â. Разогрев систем проводили при постоянном объеме, уравновешивание и 10 не динамику - при постоянном давлении. Регуляция температуры осуществлялась термостатом Ланжевена. Для ускорения молекулярнодинамических расчетов использовали алгоритм SHAKE, фиксирующий длины связей, включающих атом водорода. При минимизации энергии SHAKE был отключен для улучшения сходимости. Шаг интегрирования составлял 0,002 пс.
2.3.3 Управляемая молекулярная динамика
Для изучения транспорта через субстратный канал использовались структуры ФДГ, полученные в результате 10 не симуляции систем Ъ «открытая конформация со связанным коферментом» и d «закрытая конформация со связанным коферментом». Молекулу формиата локировали в область остатка Lys286, расположенного у входа в субстратный канал. Полученную систему минимизировали, разогревали и уравновешивали по описанной выше методике. Во время уравновешивания использовали ограничение на расстояние формиат-Ьуз286 с константой 1 ккал/(моль-А2) для того, чтобы исключить уход формиата в растворитель. Затем проводили моделирование с использованием управляемой молекулярной динамики, в ходе которого ограничивали расстояние формиат-Аяп146. Пружину присоединяли одним концом к С-атому формиата, а другим - к С“-атому остатка активного центра Asnl46, в ходе расчета равновесную длину пружины уменьшали, чтобы направить формиат к активному центру. Константа жесткости пружины составляла 150nH/Â, скорость уменьшения длины пружины 5 Â/hc.
2.3.4 QM/MM симуляция
При изучении комплекса Михаэлиса ФДГ использовали полуэмлирический QM/MM метод, реализованный в пакете Amber73. В качестве стартовой точки принимали уравновешенную в результате 500 пс классической молекулярнодинамической симуляции систему е «закрытая конформация со связанным коферментом и субстратом». QM регион включал формиат и фрагмент молекулы NAD+ (рис. 2-2а) и описывался полуэмпирическим гамильтонианом, ММ регион включал оставшуюся часть кофермента, белок и растворитель и описывался силовым нолем. При рассмотрении связи пересекающей границу QM и ММ регионов, использовался метод линкерного атома. Из стартовой точки провели QM/MM