Свойства митохондриальной NADH: убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) в составе мембранных препаратов мозга

• Автор: Калашников, Денис Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
введение:
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Комплекс I дыхательной цепи
Морфология
Препараты
Номенклатура субъединиц
Субъединичный состав комплекса I
Субъединицы, кодируемые митохондриальным геномом
Субъединицы, кодируемые ядерным геномом
Субъединичный состав комплекса I различных эукариот
Редокс-компоненты
О механизме трансформации энергии комплексом I
Структура комплекса I и его фрагментов
Реакции, катализируемые комплексом I
ИАБН-оксидазная реакция
МАБН:убихинон-оксидоредуктазная реакция;
МАРН:феррицианид-редуктазная реакция
ИАРН.-гексааминорутений (Ш)-редуктазная реакция
Трансгидрогеназная реакция
ИАБЬЕфумарат редуктазная реакция
Генерация супероксид-радикала
Обратный перенос электронов
Ингибиторы комплекса I
Медленные обратимые изменения каталитической активности:
активная и деактивированная формы
Посттрансляционные модификации комплекса I
Фосфорилирование
Глутатионилиров ание
Об измерении активности комплекса 1 в интактных митохондриях
Некоторые физико-химические свойства жирных кислот
Влияние жирных кислот на процессы, происходящие в митохондриях... Влияние жирных кислот на каталитическую активность комплекса I

j МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Препаративные методы
Получение митохондрий сердца крысы
| Получение митохондрий мозга крысы
] Получение «препарата белков митохондриального матрикса»
Получение препарата митохондрий мозга,
* проницаемых для низкомолекулярных соединений
| Получение митохондрии мозга свиньи
I Активация и деактивация субмитохондриальных частиц мозга
Аналитические методы
Измерение поглощения кислорода
Измерение NADH-оксидазной активности
. Измерение ИАПН^гредуктазной активности
Измерение ИАПН:гексааминорутений (III)-редуктазной активности
I Обратный перенос электронов на NAD+,
поддерживаемый аэробным окислением сукцината
I Обратный перенос электронов на феррицианид,
поддерживаемый аэробным окислением сукцината
Генерация супероксид-радикала

Определение содержания гема а в полученных препаратах
Определение количества комплекса I в полученных препаратах
Определение содержания белка в полученных препаратах
< Реактивы
• РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Митохондрии мозга
Получение и свойства
Влияние пальмитиновой кислоты на оксидазные активности
} Субмитохондриальные фрагменты мозга
Получение и свойства
1 Активная и деактивированная формы комплекса
Ингибирование каталитической активности комплекса I
жирными кислотами: влияние Са2+
Влияние альбумина и белков митохондриального матрикса > на торможение NADH-оксидазной активности пальмитиновой кислотой
) ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА, бычий сывороточный альбумин;
дтт, 1,4-дитиотреитол;
ДТНБ, 5,5’-дитио-бис (2-нитробензойная кислота);
СМЧ, субмитохондриальные частицы;
С-СМЧ, субмитохондриальные частицы сердца быка;
м-смч, субмитохондриальные частицы мозга;
Мо-СМЧ, субмитохондриальные частицы мозга, полученные из суммарной фракции митохондрий мозга свиньи;
Мт-СМЧ, субмитохондриальные частицы мозга, полученные из «тяжелых» митохондрий мозга свиньи;
ПААГ, полиакриламидный гель;
ЭПР, электронный парамагнитный резонанс;
ББ-Ыа, додецилсульфат натрия;
Дри+, трансмембранный электрохимический градиент протонов;
Дір, разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны;
БАБ, флавинадениндинуклеотид;
Бе-Б, железо-серный кластер;
FMN, флавинмононуклеотид;
БССР, п-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон;
ББН восстановленный глутатион;
ББББ окисленный глутатион;
N04-1, прокариотическая ЫАБН дегидрогеназа 1-го типа;
КЕМ К-этилмалеимид
Оп, водорастворимый гомолог природного убихинона, содержащий п изопреноидных остатков в положении 5 1,4-бен-зохинонового кольца;

Хорошо известно, что дышащие митохондрии способны аккумулировать большие количества кальция. Концентрация свободного Са2+ в митохондриальном матриксе зависит от многих факторов, таких как природа проникающего аниона, рН> или присутствие нуклеотидов [Rizutto et al., 1992; Rutter et all, 1996; Szalai et ah, 2000; Kristian et ah, 2002;, Nicholls-and Ferguson, 2002; Chalmers and Nicholls, 2003; Сарис и Карафоли, 2005; Perocchi et ah, 2010] (в соответствующих условиях митохондрии из нервной ткани могут накапливать от 2 до 4 мкмоль Са2+ на мг белка [Chinopoulos et ah, 2003], что соответствует концентрации Са2+ в матриксе 2-4 М), поэтому роль-ионов двухвалентных металлов (в частности, Са2+) в регуляции активности комплекса I заслуживает внимания.
Ингибирование активности митохондриального комплекса I (СМЧ сердца крысы) под действием Са2+ обнаружили Matsuzaki, and Szweda. [Matsuzaki and Szweda, 2007]. Sharpley and Hirst детально описали ингибирование активности изолированного митохондриального комплекса I под действием Zn2f (а также, по данным авторов, менее эффективных в этом отношении Mg2+, Ва2+, Mn2+, Со2+, Си2+)- с ICso - Ю мкМ [Sharpley and Hirst, 2006]. С другой стороны, Sazanov и соавт. продемонстрировали стабилизирующее влияние двухвалентных катионов и фосфолипидов при выделении и очистке фермента прокариот [Sazanov et ah, 2003]. Суммируя эти факты, можно предположить, что существует возможность регулирования каталитической активности комплекса I ионами Са2+, аккумулированными в митохондриях.
При повышении, температуры в отсутствие субстратов комплекс I спонтанно переходит в деактивированное состояние. Активационный барьер перехода из активного в деактивированное состояние очень высок и составляет 270 кДж/моль, что свидетельствует о существенных структурных перестройках в молекуле белка. Так как в присутствии NADH все железо-серные центры как в активной, так и в деактивированной формах фермента восстановлены, то процессы, ответственные за активацию/деактивацию, связаны с терминальной частью фермента, несущей участок связывания хинона [Kotlyar and Vinogradov, 1990].
Медленные обратимые переходы двух форм комплекса I прослежены в ряду изолированный фермент [Maklashina et al., 1994], комплекс I в составе С-СМЧ [Kotlyar and Vinogradov, 1990] и обнаружены в интактных митохондриях