+
Действующая цена700 499 руб.
Товаров:
На сумму:

Электронная библиотека диссертаций

Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО

Расширенный поиск

Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей

  • Автор:

    Смагин, Владимир Анатольевич

  • Шифр специальности:

    03.01.04

  • Научная степень:

    Кандидатская

  • Год защиты:

    2011

  • Место защиты:

    Москва

  • Количество страниц:

    114 с. : ил.

  • Стоимость:

    700 р.

    499 руб.

до окончания действия скидки
00
00
00
00
+
Наш сайт выгодно отличается тем что при покупке, кроме PDF версии Вы в подарок получаете работу преобразованную в WORD - документ и это предоставляет качественно другие возможности при работе с документом
Страницы оглавления работы

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. ДНК-лигазы: структура, механизм реакции и функции
2. Археи: особенности метаболизма и реализации генетической информации
3. ДНК-лигазы архей
4. Практическое применение термостабильных ДНК-лигаз
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи штамма 1
1.1 Определение филогенетического положения штамма 1
1.2 Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена Іі§ТЬ1519
1.3. Клонирование гена ІіКТЬ 1519, экспрессия и очистка рекомбинантного белка
1.4. АТФ-зависимос лигирование когезивных концов ДНК фага X лигазой 1^Т1П
1.5. Влияние температуры, pH и концентрации солей на активность ДНК лигазы 1лёТЫ
1.6 Термостабильность лигазы ЫйТЫЗЩ
1.7 Определение специфичности ДНК-лигазы І^ТІї 1519 в отношении кофактора.
2. Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи рода АскШоЬиэ
2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена ^Ас 1904
2.2. Клонирование гена ^Ас1904, экспрессия и очистка рекомбинантного белка
2.3. Лигирование когезивных концов ДНК фага X лигазой Ьі§Ас 1
2.4. Влияние температуры, pH, концентрации солей на активность ДНК лигазы Ы§Ас1
2.5. Определение специфичности ДНК-лигазы ЕІ"Ас1904 в отношении кофактора.
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Аминокислотные последовательности ДНК-лигаз 1^ТЫ519 Тйегшососсиз яр. 1519 и І^Ас1904 АсісШоЬиБ Бр 1
2. Биохимические характеристики выделенных ДНК-лигаз
3. Зависимость от кофактора и эволюция ДНК-лигаз
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
ДНК-лигазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма ДНК и принимают участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации у всех живых организмов (Lehman. 1974; Li et al., 1984; Wood et al., 1988; Jessberger et al., 1991; Doherty et al.,2000; Shuman et я/,,2004; Tomkinson et al,2006; Wilkinson et al.,2001). Эти ферменты катализируют связывание 5’-фосфатного с 3’-гидроксильным концов в одноцепочсчиом разрыве двухцепочечной ДНК или же в двух фрагментах ДНК, содержащих либо комплементарные одноцепочечные, либо тупые концы.
Вместе с РНК-лигазами и мРНК-кэпирующими ферментами, ДНК-лигазы формируют группу ковалентных нуклеотпдилтрансфераз. ДНК-лигазы могут быть разделены на два семейства в соответствии с используемыми кофакторами - источниками энергии, - АТФ-зависимые (ЕС 6.5.1.1) и НАД - зависимые лигазы (ЕС 6.5.1.2) (Timson et al., 1999; Sriskanda et al., 2000). На данный момент изучены функции ДНК-лигаз и получены кристаллические структуры представителей обоих семейств (Subramanya et al., 1996; Lee et al., 2000; Odell et al., 2000; Pascal et al., 2004). Осущес твляемая ДНК-лигазами ферментативная реакция состоит из трех этапов. На первом этапе ДНК-лигаза атакует а-фосфат нуклеотидного кофактора с образованием ковалентного интермедиата фермент-аденплат, в котором АМФ связан фосфоамидиой связью с е-амнногруппоп лизина. Для АТФ-зависимого типа ДНК-лигаз основным источником АМФ группы является АТФ, в то время как для НАД+-зависимых — НАД+ (Wilkinson et al., 2001). В случае если в качестве кофактора используется АТФ, образование интермедиата фермент-аденилат сопровождается высвобождением пирофосфата, если же НАД+ - то никотинамидмононуклеотида. На втором этапе АМФ переносится на 5’-конец 5’-концевого фосфата ДНК-цепи с формированием ДНК-аденилата (AppN). На завершающем этапе ДНК-лигаза катализирует атаку 3’- ОН гидроксильной группы в однонитевом разрыве на ДНК-аденилат с соединением двух полинуклеотидов и высвобождением АМФ (Lehman, 1974; Doherty and Suh 2000; Lehman 1974; Shuman and Lima 2004; Timson et al.. 2000; Wilkinson et al., 2001). Структуры нескольких ДНК-лигаз, полученные с высоким разрешением, показали наличие модульной структуры, с общим аденилтрансферазным кором, связанным с другими доменами, связывающими субстрат (Doherty and Suh, 2000; Shuman and Lima, 2004; Tomkinson et al., 2006).
АТФ-зависимые ДНК-лигазы найдены в бактериофагах, некоторых бактериях, археях, эукариотах и эукариотических вирусах, в то время как НАД+-завиеимые ДНК-лигазы встречаются в основном у бактерий (Martin and MacNeill, 2002; Luo et al.. 1996;

Gerry et al., 1999; Singleton et al., 1999; Timson et al., 1999; Tong et al., 1999; Sriskanda et al., 2000; Sriskanda et al., 2001; Wilkinson et al. 2001). Наряду с эукариотами и бактериями, археи образуют отдельный домен живых организмов (Woese, 1977). Археи являются одноклеточными организмами, обитающими, как правило, в экстремальных условиях окружающей среды, характеризующихся высокой или низкой температурой, экстремальными значениями pH и т.п. Основные пути метаболизма у археи и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации, включая ДНК лигазы, более близок к эукариотическому (Kelman and White 2005; White 2003).
Геномы практически всех архей содержат единственный ген ДНК-лигазы АТФ-зависимого типа. Так. анализ аминокислотной последовательности первой охарактеризованной архейной ДНК-лигазы, из Desulfurolobus ambivalens, показал ее сходство с АТФ-зависимыми ДНК-лигазами эукариот и эукариотических вирусов (Kletzin. 1992; Nakatani et al., 2000). Позднее было охарактеризовано несколько других архейных ДНК-лигаз (Nakatani et al., 2000; 2002; Sriskanda et al., 2000; Lai et al.. 2002; Jeon and Ishikawa, 2003; Rolland et al., 2004; Keppetipola and Shuman, 2005; Kim et al., 2006; Sun et al., 2008; Ferrer et al., 2008; Jackson et al., 2007; Zhao et al., 2006; Seo et al., 2007 и др.). В основном, ДНК-лигазы архей очень схожи по своим размерам и консервативны по первичной структуре. Последующие исследования ДНК-лигаз архей в отношении специфичности к нуклеотидному кофактору показали, что архейные лигазы используют исключительно АТФ (Bult et al., 1996; Klenk et al., 1997; Timson et al., 1999; Lai et al., 2002; Keppetipola et al., 2005). Это представление подтверждалось характеристикой ДНК-лигаз из архей Methanobacterium thermoautotrophicum (Timson et al., 1999), Archaeoglobus fulgidus (Klenk et al., 1997), Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996), Sulfolobus shibatae (Lai et al., 2002) and Pyrococcus horikoshii OT3 (Keppetipola et al., 2005). Однако, недавно были получены данные о том, что архейные ДПК-лигазы могут использовать и другие кофакторы. Так, использовать НАД+ наряду с АТФ могут ДПК-лигазы Thermococcus fumicolans (Rolland et al., 2004). Thermococcus, kodakaraensis KOD1 (Nakatani et al., 2000), Thermococcus onmirineus NA1 (Kim et al., 2006), Pyrococcus abyssi (Rolland et al., 2004). Специфичностью к АТФ и АДФ обладают лигазы из Легоругит pernix (Jeon el al, 2003) и Staphylothermus marinus (Seo et al., 2007). Эти данные позволяют предположить, что некоторые архейные ДНК-лигазы могут представлять неспециализированные предковые ферменты, являющиеся эволюционными предшественниками кофактор-специализированных ДНК-лигаз (Seo et al., 2007). Эту точку зрения поддерживает недавнее открытие архейной ДНК-лигазы из Svlfophobococcus zilligii, которая обладает

Причем, данные экспериментов говорят о том, что лигаза использует одни и те же каталитические остатки в обоих случаях.
Для ДНК-лигазы Pyrococcus horikoshii (Keppetipola et al., 2005) было проведено биохимическое исследование как аденилилтрансферазной активности (с использованием [32Р]АТФ, так и активности по сшиванию ников. В целом, параметры для первого этана реакции являются схожими с таковыми для всей реакции, за исключением более специфичного требования к двухвалентным катионам в последнем случае. Аденилирование усиливалось при повышении концентрации АТФ до 10 рМ и достигало насыщения при 20 рМ.
Естественным следствием независимости первого этапа реакции от последующих является наличие аденилированной фракции фермента в препаратах лигаз. Так в эксперименте по аденилилтрансферазной активности, только 40% препарата ДНК-лигазы Pyrococcus horikoshii, выделенного из Е. coli, подверглось аденилированию, показывая, что остальная часть препарата была предаденилирована. Также, значительный уровень лигирования пикированной ДНК обнаруживался без добавления кофактора, что свидетельствует о наличии аденилированной фракции фермента. Увеличение АТФ-независимого лигирования было субстехеометрическим по отношению к количеству лигазы, как и ожидалось для single-turnover реакции с участием предаденилированной фракции фермента в препарате рекомбинантного белка. Сравнение лигирования с АТФ и без, при 0.5 пМ лигазы P. horikoshii, показало, что добавление АТФ увеличивает активность фермента в 12 раз. Было рассчитано, что 45% препарата рекомбинантного белка составляет лпгаза-АМФ. В случае препарата рекомбинантного фермента Sulfolobus shibatae(Lai et al., 2002), выделенного из Е. coli, часть фермента, также, была предаденилирована.
В случае экспериментов с ДНК-лигазой P. horikoshii (Keppetipola et al., 2005) было показано, что НАД+ не оказывает влияния на реакцию, в то время как АДФ оказывает концентрационно-зависимое ингибирование лигирования предаденилированным ферментом (2мМ АДФ вызывал трехкратное уменьшение реакции). Наиболее вероятным объяснением ингибирующего действия АДФ на реакцию лигирования, а также случаев ингибирования устойчивого лигирования повышенными концентрациями АТФ, является то, что при высоких концентрациях АТФ и АДФ могут служить ловушками-акцепторами для переноса АМФ с лигазы-АМФ, с образованием динуклеозидполифосфатов (Atencia el al., 1999; Gunther Sillero et al., 2002; Atencia et al., 1998), мешая ферменту сшивать ДНК. Также, было показано, что трифосфаты (НТФы) могут служить такими ловушками. В

Рекомендуемые диссертации данного раздела

Время генерации: 0.169, запросов: 967