Полиреактивность иммуноглобулинов молока человека как результат обмена их структурными компонентами

• Автор: Седых, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Иммуноглобулины
1Л Л Классификация и структура
1Л .2 Механизмы, обеспечивающие разнообразие антигенсвязывающих участков
1.2 Каталитически активные антитела
1.2Л Возможные механизмы образования абзимов
1.2.2 Природные абзимы при аутоиммунных заболеваниях
1.2.3 Абзимы молока человека
1.2.4 Абзимы, гидролизующие нуклеиновые кислоты
1.2.5 Абзимы с амилолитической активностью
1.2.6 Абзимы с нуклеотидфосфатазной активностью
1.2.7 Абзимы с липидкиназной и полисахаридкиназной активностью
1.3 Биологическая роль абзимов человека
1.4 Полиреактивность иммуноглобулинов
1.4.1 Лабильность антигенсвязывающего центра
1.4.2 Полиреактивность димеров 1§0
1.4.3. Обмен 1§в4 НЬ-фрагментами
1.4.5.Полиреактивность после действия факторов, дестабилизирующих белки
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение иммуноглобулинов
2.2.2 Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
2.2.3 Определение концентрации белка
2.2.4. Получение хроматографических сорбентов
2.2.4.1 Получение липид-сорбента

2.2.5. Электрофоретический анализ белков
2.2.6. Вестерн-блот
2.2.7. Аффинная хроматография на ДНК-целлюлозе
2.2.8 Аффинная хроматография на сефарозах с иммобилизованными антигенами
2.2.9. Аффинная хроматография на сефарозах с иммобилизованными антителами
2.2.10. Определение ДНК-гидролизующей активности
2.2.11. Определение амилолитической активности
2.2.12 Определение нуклеотидфосфатазной активности
2.2.13 Определение липидкиназной активности
2.2.14. Определение полисахаридкиназной активности
2.2.15. Определение казеинкиназной активности
2.2.16 Иммуноферментный анализ
2.2.17. Гель-фильтрация
2.2.18 Модификация белков радиоактивным фосфором
2.2.19. Модификация белков флюоресцеинизотиоцианатом
2.2.19.1. Спектрофлюориметрический анализ модифицированных
иммуноглобулинов
2.2.20 Получение конъюгатов с пероксидазой хрена
2.2.21. Обмен иммуноглобулинов НЬ-фрагментами
2.2.22. Получение тяжелых и легких цепей 1§С
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение иммуноглобулинов
3.2. Разделение иммуноглобулинов на аффинных сорбентах
3.3 Анализ каталитических активностей абзимов
3.3.1 Анализ каталитических активностей фракций 1§0 и вА с разным сродством к ДНК целлюлозе и АТР-сефарозе
3.3.2 Последовательное разделение 1§0 и эА на нескольких аффинных сорбентах
3.3.3 Каталитическая полиреактивность антител
3.4 Иммуноглобулины, содержащие легкие цепи разных типов
3.5 Иммуноферментный анализ
3.6 Обмен иммуноглобулинов молока человека НЬ-фрагментами
4 ВЫВОДЫ
5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Подклассы IgG отличаются в основном по структуре шарнирного участка, который в случае IgG4 и IgG2 на три аминокислотных остатка короче, чем у IgGl. Как и IgGl, IgG4 содержит два остатка цистеина, которые ковалентно связывают тяжелые цепи. Некоторая часть (по разным оценкам, от 5-10 % до более 45 %) IgG4 не имеет ковалентных связей между тяжелыми цепями, однако сохраняет молекулярную массу около 150 кДа. Образование дисульфидной связи внутри одной тяжелой цепи выгоднее с точки зрения энтропии, чем образование такой связи между разными тяжелыми цепями. В случае IgG4 шарнирный участок имеет одну аминокислотную замену по сравнению с IgGl, что обуславливает способность IgG4 к образованию параллельных дисульфидных связей между цепями [242]. СНЗ-домен IgG4 отличается от IgGl лишь тремя остатками аминокислот, два из них лежат близко к концу полипептида, в то время как один находится в районе димеризации. Так как СНЗ-домены IgG4 связаны прочными нековалентными взаимодействиями, IgG4 представляет собой прочную молекулу из четырех полипептидных цепочек, и не подвергается обмену HL-фрагментами в стандартных условиях in vitro.
Природные поликлональные IgG4 являются функционально моновалентными, в то время как рекомбинантные IgGl и IgG4 могут перекрестно связывать разные антигены и являются бивалентными. Исследования сыворотки крови пациентов, получавших терапевтические инъекции двух аллергенов, показали, что мономерные IgG4 перекрестно взаимодействуют с обоими антигенами, при этом в плазме крови биспецифичные иммуноглобулины в основном представлены IgG4. Сыворотки, из которых удалены IgG4, с несколькими антигенами перекрестно не взаимодействуют. Количество биспецифичных IgG4 приближается к значению, предсказанному полным случайным обменом HL-фрагментами, часть IgG4 не имеет ковалентных связей между тяжельми цепями, и их структура поддерживается нековалентными взаимодействиями. По-видимому, в обмене принимают участие все IgG4 плазмы крови, а не только те, которые не имеют дисульфидные связи между тяжелыми цепями [236, 237, 238, 243].
IgG4 обычно вырабатываются при постоянном контакте с антигеном или в результате продолжительной иммунизации высокими дозами растворимых антигенов. Иммунный ответ, вызванный наработкой в основном IgG4, описан для пациентов: получающих иммунотерапию, пчеловодов, больных хроническими паразитарными инфекциями, пациентов с гемофилиией, получающих фактор VIII [237]. У пчеловодов в течение первых 6 месяцев иммунизации образуются исключительно IgGl, далее титры IgGl снижаются, a IgG4 повышаются и достигают 90%. В ранних и поздних сыворотках