Субстратная специфичность нуклеозидфосфорилаз Escherichia coli

• Автор: Алексеев, Кирилл Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Список использованных сокращений:
Введение
Глава 1. Структурные особенности нуклеозидфосфорилаз (Обзор литературы)
1.1. Общие характеристики ферментов
1.2. Структура тимидинфосфорилаз
1.3. Структура уридинфосфорилаз
1.4. Структура пуриннуклеозидфосфорилаз
Глава 2. Субстратная специфичность нуклеозидфофорилаз E
2.1. Общая характеристика ферментов и методы изучения кинетики и констант
равновесия
2.2. Субстратная специфичность ТФ
2.3. Субстратная специфичность УФ
2.4. Субстратная специфичность ПНФ
Глава 3. Экспериментальная часть
Выводы
Список литературы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов аминокислот, а также нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:
Ado/Ade - аденозин/аденин
Guo/Gua - гуанозин/гуанин
Ino/Hyp - инозин/гипоксантин
Urd/Ura - уридин/урацил
Thd/Thy - тимидин/тимин
4SUrd/4SUra - 4-тиоуридин/4-тиоурацил
4SThd/4SThy - 4-тиотимидин/4-тиотимин
УФ - уридинфосфорилаза
ТФ - тимидинфосфорилаза
ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХ/МС — хромато-масс-спектрометрия
КССВ — константа спин-спинового взаимодействия
ТСХ — тонкослойная хроматография
ДМСО — диметилсульфоксид,
ДМФА— диметилформамид ТГФ, - тетрагидрофуран АсОН - уксусная кислота AcOEt —этилацетат
DBU — 1,8-ди-азабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
ЕЮН — этиловый спирт
RT — время удержания (retention time)
MeCN — ацетонитрил MeOH — метиловый спирт
Tris — трис(гидроксиметил)аминометан [2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол]
Ру - пиридин
Нумерация схем, таблиц и рисунков в экспериментальной части соответствует нумерации в обсуждении результатов. В обзоре литературы отдельная нумерация.

ВВЕДЕНИЕ
Большое количество ферментов катализирует реакции биосинтеза и деградации нуклеотидов. Одним из типов таких ферментов нуклеинового обмена являются нуклеозидфосфорилазы. Они участвуют в дополнительном пути биосинтеза нуклеозидов и катализируют обратимую реакцию расщепления нуклеозидов по гликозидной связи с образованием гетероциклического основания и 1-фосфата моносахарида. К нуклеозидфосфорилазам относятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Эти ферменты обнаружены почти у всех организмов, при этом отличия их первичной структуры сравнительно невелики [1].
В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности нуклеозидфосфорилаз, которые могут быть использованы в качестве маркеров онкологических заболеваний [2]. Эти ферменты применяются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически важных нуклеозидов [3-5]. В качестве примера можно привести известные ферментативные превращения нуклеозидов под действием УФ и ПНФ: ß-D-арабинофуранозилурацил + УФ + неорганический фосфат —> урацил + а-£>-арабинофуранозил-1-фосфат + ПНФ + аденин —> ß-£>-
арабинофуранозиладенин. Также нуклеозидфосфорилазы используются для количественного определения неорганического фосфата [6].
Следует отметить, что субстратная специфичность этих ферментов исследована недостаточно полно. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров фосфоролиза нуклеозидов. Несмотря на большое количество работ, посвященное рассматриваемым ферментам, не определена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и гетероциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для практического применения нуклеозидфосфорилаз. Вышесказанное и определяет актуальность и большой интерес к изучению субстратной специфичности и архитектуры активного центра этих ферментов.
Целью работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз E. coli. В ходе исследования решались следующие задачи: разработка удобных методов определения констант равновесия, констант Михаэлиса и констант ингибирования для этих ферментов; изучение фосфоролиза большой группы нуклеозидов, модифицированных как по углеводному остатку, так и гетероциклическому основанию; изучение роли гидроксильных групп нуклеозидов в связывании с

Рисунок 9. Комплекс тримерной ПНФ из Cellulomonas с фосфатом. [122].
Каталитически активная ПНФ Cellulomonas представляет собой три идентичные субъединицы, состоящие из 284 аминокислотных остатков и образующие тример. Большинство контактов субъединиц приходятся на гидрофобные взаимодействия. Для характеристического анализа вклада гидрофобных контактов в межсубъединичные взаимодействия исследовались аминокислотные остатки смежных субъединиц, находившиеся на расстоянии не более 4,5 Ä друг от друга. Предполагают, что число аминокислотных остатков, участвующих в тримеризации молекулы ПНФ Cellulomonas равно 37 из 284, что составляет около 13% от общего их количества в субъединице. На долю остатков, формирующих гидрофобные взаимодействия, приходится 18 аминокислот из 37 [122]. Остатки, участвующие в тримеризации, расположены в области спирали aVII (13 аминокислотных остатков в районе 199-213) и длинной петли, соединяющей цепь ß6 и спираль aV в районе 153-174 (рисунок 9). В дополнение к этому, в тримеризации участвуют остатки 107, 194, 222, 229, 249.
В кристаллической структуре нативной ПНФ E. coli остатки 214-236 около С-конца во всех шести мономерах образуют длинную Н8 a-спираль (в работе [129] эта спираль обозначена а7), концевая часть которой обладает конформационной подвижностью [129]. Анализ полученных кристаллов ПНФ E. coli в комплексе с формицином В обнаружил, что только в одной из трех симметрично-независимых субъединиц эта спираль сегментирована на две Н8 и Н8' за счет образования у-изгиба остатками 220-222; в соседней субъединице такой сегментации спирали Н8 не происходит (рисунок 10). В молекуле фермента происходит последовательное чередование мономеров с сегментированной и несегментированной спиралью Н8 [125].