Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции

• Автор: Пупов, Данил Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список используемых сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цели и задачи исследования
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Часть 1. Структура и функции бактериальной РНКП. Взаимодействия РНКП с ДНК и РНК на разных стадиях транскрипции
1.1. Введение
1.2. Структура бактериальной РНКП
1.2.1. Структура кор-фермента РНКП
1.2.2. Структура холофермента РНКП
1.2.3. Структура а-субъединицы
1.3. Структурные модели транскрипционных комплексов
1.3.1. Структурная модель промоторного комплекса
1.3.2. Структурная модель элонгационного комплекса
1.4. Механизмы работы активного центра РНКП
1.4.1. Реакции, катализируемые РНКП
1.4.2. Механизм синтеза РНК
1.4.3. Механизм транслокации РНКП
Часть 2. Взаимодействия РНКП с некодирующими нуклеиновыми кислотами
1.5. Неканонические транскрипционные матрицы
1.5.1. Система синтеза затравки для отстающей цепи при репликации плазмид по типу катящегося кольца
1.5.2. Система синтеза затравки при репликации нитевидных фагов
1.5.3. Репликация вироидов: РНКП может использовать РНК в качестве матрицы для транскрипции
1.5.4. Регуляция транскрипции у прокариот с помощью 6S РНК
1.6. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Плазмиды
2.3. Питательные среды и антибиотики
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.5. Выделение плазмидной ДНК
2.6. Выделение ДНК из агарозы
2.7. Получение промоторных фрагментов ДНК
2.8. Получение радиоактивно-меченых олигонуклеотидов
2.9. Электрофорез белков в денатурирующем геле
2.10.Определение концентрации белка
2.11. Суперпродукция РНКП E.coli
2.12. Выделение РНКП E. coli с заменами в районах SW2 и FL
2.13. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем геле
2.14. Транскрипция in vitro

2.14.1. Тест по синтезу полноразмерных РНК-продуктов
2.14.2. Тест по синтезу абортивных РНК-продуктов
2.14.3. Транскрипция на аптамерных матрицах
2.14.4. Тест по определению скорости элонгации
2.14.5. Тест по определению продолжительности транскрипционных пауз
2.15. Измерение Кд комплексов олигонуклеотидов с РНКП
2.16. Определение кинетики диссоциации промоторных комплексов в присутствии гепарина
2.17. Определение кинетики диссоциации элонгационных комплексов при высокой ионной силе
2.18. Тест для исследования кинетических характеристик РНКП
2.19. Футпринтинг перманганатом калия
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование одноценочечных ДНК-аптамеров к холоферменту РНКП и промоторов на их основе
3.1.1. Анализ первичной и вторичной структур аптамеров, полученных при отборе к холоферментам РНКП E. coli и Т. thermophilus
3.1.2. Получение укороченных производных аптамеров и исследование их связывания с холоферментами РНКП E. coli и Т. thermophilus
3.1.3. Исследование транскрипционной активности РНКП E. coli на аптамерной матрице hEcap6/51 и определение точки начала синтеза РНК
3.1.4. Исследование роли промоторных элементов в инициации транскрипции на аптамерных матрицах
3.1.5. Аптамеры к холоферменту РНКП, как новая модель для исследования механизма инициации транскрипции
3.2. Анализ функциональной роли района switch2 ß'-субъединицы РНКП E. coli на разных стадиях транскрипции
3.2.1. Общая транскрипционная активность РНКП E. coli с заменой аминокислотного остатка R
3.2.2. Влияние замен остатка R339 в РНКП E. coli на связывание инициаторных субстратов
3.2.3. Исследование стабильности промоторных комплексов РНКП с заменами остатка R
3.2.4. Влияние замен остатка R339 в районе SW2 на плавление РНКП дуплекса ДНК при образовании открытого промоторного комплекса
3.2.5. Исследование эффективности ухода с промотора РНКП с заменами остатка R339 в районе SW
3.2.6. Влияние замен аминокислотного остатка R339 в районе SW2 на работу РНКП на стадии элонгации транскрипции
3.2.7. Влияние замен остатка R339 в районе SW2 на эффективность действия на РНКП антибиотика рифампицина
3.2.8. Функциональная роль района SW2 РНКП на разных стадиях транскрипции
3.3. Анализ функциональной роли района fork-loop2 ß-субъединицы РНКП на разных
стадиях транскрипции
3.3.1. Исследование влияния аминокислотных замен в районе FL2 на стабильность промоторного комплекса РНКП

3.3.2. Исследование влияния замен аминокислотных остатков в районе FL2 на эффективность процесса ухода РНКП с промотора
3.3.3. Исследование влияния замен аминокислотных остатков в районе FL2 на работу РНКП на стадии элонгации транскрипции
3.3.4. Исследование узнавания регуляторного сигнала his-паузы РНКП E. coli
3.3.5. Исследование влияния замен в районе FL2 РНКП E. coli на узнавание регуляторных сигналов his-пауз на стадии элонгации транскрипции
3.3.6. Исследование узнавания регуляторных сигналов ops-пауз РНКП E. coli на стадии элонгации транскрипции
3.3.7. Функциональная роль района FL2 РНКП на разных стадиях транскрипции
3.4. Заключение
4. ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Благодарности
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Часть 2. Взаимодействия РНКП с некодирующими нуклеиновыми кислотами
1.5. Неканонические транскрипционные матрицы
Достаточно давно было обнаружено, что, кроме узнавания классических промоторов, РНКП способна к специфическому узнаванию с последующей транскрипцией некоторых неканонических матриц, отличающихся по своей структуре от типичного двунитевого промотора. Однако, механизмы инициации транскрипции на таких матрицах в основном оставаясь неизвестны. В последние годы были достаточно подробно исследовано несколько примеров взаимодействий РНКП с различными неканоническими матрицами. В настоящем обзоре рассмотрены несколько наиболее изученных примеров неканонических транскрипционных матриц: ориджины репликации нитевидных фагов; оцДНК-ориджины (sso, single-strand origins) отстающих цепей, синтезируемых при репликации плазмид по типу катящегося кольца; РНК промоторы вироидов; некоторые регуляторные некодирующие РНК. Интерес к исследованию механизмов узнавания неканонических матриц РНКП связан не только необходимостью понимания функционирования каждой из перечисленных систем, но и тем, что анализ взаимодействий РНКП с различными типами матриц и особеностей механизмов синтеза РНК в них позволит в целом глубже понять фундаментальные механизмы транскрипции.
1.5.1. Система синтеза затравки для отстающей цепи при репликации плазмид по типу катящегося кольца
Механизм репликации плазмид по типу катящегося кольца был обнаружен более 20 лет- назад (Koepsel et al., 1985). Считалось, что найденный механизм является исключением, и большая часть плазмид реплицирутся по 0-механизму. Однако, позже было выяснено, что очень многие плазмиды используют механизм катящегося кольца для своего размножения. Известно, что большинство небольших мультикопийных плазмид Грам-положительных бактерий используют для своей репликации механизм катящегося кольца - это так называемые RC-плазмиды (от rolling circle). Более того, хозяевами плазмид с таким циклом репликации могут являться Грам-отрицательные бактерии и даже археи. RC плазмиды разделяются по крайней мере на 4 семейства по сходству структур ориджинов репликации, члены внутри семейства имеют высокую степень гомологии в этих участках (Khan, 2000)