Структурно-функциональный анализ транскриптома Mycobacterium tuberculosis при развитии инфекции in vivo

• Автор: Скворцов, Тимофей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 191 с. : ил.

Содержание
Содержание
Список сокращений и биологических терминов
Обзор литературы
Транскрнптомика Mycobacterium tuberculosis in vivo
Введение
I. Методология исследования экспрессии генов внутриклеточных патогенов
1. 1. Свойства бактериальной РНК
1. 2. Методы анализа экспрессии генов in vivo
1. 3. Амплификация РНК и синтез бактериальной кДНК
I. 4. Обогащение с использованием гибридизационных методов
I.5. Анализ бактериальных транскриптомов при помощи метода RNA-seq
II. Функциональный анализ транскриптомов Mycobacterium tuberculosis
II. 1. Mycobacterium tuberculosis', патогенез
II. 2. Молекулярная биология M.tuberculosis
II. 3. Функциональный анализ транскриптомов М. tuberculosis
II. 4. Эксперименты по полнотранскриптомному анализу Mycobacterium tuberculosis in vivo, используемые модели инфекции
И. 5. Модели инфекции Mycobacterium tuberculosis
A) Искусственная гранулема
B) Фагоциты хозяина
В) Моделирование инфекции М. tuberculosis в лабораторных животных
Г) Исследование транскриптома Mycobacterium tuberculosis из тканей человека. .34 II. 6. Внутриклеточный транскриптом М. tuberculosis
A) Метаболизм липидов
Б) Энергетический метаболизм: клеточное дыхание
B) Биосинтез белков и клеточный рост
Г) Защитные механизмы, репарация ДНК
Д) Клеточная стенка, мембрана и транспорт
Е) Факторы вирулентности Mycobacterium tuberculosis
Ж) Регуляция транскрипции
II. 7. Динамика изменения транскриптома Mycobacterium tuberculosis - от первичного инфицирования через латентное состояние к реактивации
Заключение
Материалы и методы
I. Материалы и лабораторное оборудование
I. 1. Оборудование
1.2. Расходные материалы

I. 3. Ферментативные препараты и соответствующие им буферные системы
I. 4. Химические реактивы
I. 5. Геномная ДНК, бактериальные штаммы, плазмиды
1. 6. Буферные и другие растворы
I. 7. Олигонуклеотиды, использованные в работе
II. Методы и протоколы
И. 1. Электрофоретическое разделение фрагментов нуклеиновых кислот в агарозном геле.
II. 2. Определение концентрации фрагментов ДНК (РНК)
11.3. Очистка олигонуклеотидов
II. 4. Очистка ДНК от белков и солей с помощью фенола
II. 5. Осаждение ДНК (РНК) этанолом и ацетатом натрия
II. 6. Обработка РНК ДНКазой
П. 7. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции Rsa I и Alu I
II. 8. Дизайн праймеров для ПЦР
II. 9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Основные режимы термостатирования пробирок в ходе ПЦР-амплификации (программы ПЦР)
II. 10. Лигирование фрагмента ДНК в плазмидный вектор
II. 11. Трансформация компетентных клеток вектором, несущим вставку, и высев клеток на селективную среду
II. 12. Выделение плазмид
II. 13. Определение нуклеотидной последовательности вставок рекомбинантных клонов библиотек
II. 14. Выделение геномной ДНК М. tuberculosis H37Rv
II. 15. Инфицирование животных и выделение тотальной РНК
П. 16. Синтез кДНК
II. 17. Лигирование адаптеров к фрагментам рестрикции
11. 18. Клонирование идентичных последовательностей
II. 19. Массированное параллельное пиросеквснированис обогащенных при помощи метода КлИП образцов кДНК
И. 20. Картирование прочтений
11. 21. Анализ транскриптомов
III. Компьютерное оборудование
IV. Программное обеспечение
IV. 1. VisionWorks LS Acquisition and Analysis Software
IV. 2. Gel-Pro Analyzer
IV. 3. GeneRunner
IV. 4. Primer Express Software
IV. 5. Sequence Scanner
IV. 6. Vector NTI Advance
IV. 7. Программный пакет NCBIBLAST+
IV. 8. Программы для обработки прочтений пиросеквенирования
V. Основные интернет-ресурсы
Результаты и обсуждение
I. Метод клонирования идентичных последовательностей (КлИП) и его применение для анализа бактериального транскриптома Mycobacterium tuberculosis т vivo
I. 1. Синтез тотальной кДНК
I. 2. Клонирование идентичных последовательностей (КлИП)
I. 3. Анализ библиотеки CC(ASN)
II. Сравнительный анализ экспрессии генов М. tuberculosis в легочной ткани инфицированных мышей с различной устойчивостью к заболеванию
II. 1. Получение и количественная характеристика последовательностей
М. tuberculosis, транскрибирующихся в легочной ткани мышей с генетически детерминированными различиями в устойчивости к инфекции
И. 2. Анализ транскриптомов
11.3. Некодирующие РНК
II. 4. Гены, экспрессия которых повышается при развитии инфекции
II. 5. Уникальные для каждого сравнения гены, экспрессия которых повышается при развитии инфекции
II. 6. CUGs - гены, необходимые Мtuberculosis для адаптации к различным защитным механизмам организма хозяина
II. 7. Представленность генов CUG в библиотеке CC(ASN)
Заключение
Выводы
Список цитируемой литературы
Приложение 1. Гены и межгенные участки, экспрессия которых была показана в одном или нескольких экспериментальных образцах
Приложение 2. Общая характеристика результатов пиросеквенирования и картирования прочтений 4-х библиотек
Характеристика результатов пиросеквенирования и картирования
Распределение генов по функциональным категориям
Приложение 3. Гены CUG
Приложение 4. Тексты программ, примененных в работе
Поиск и удаление прочтений, картированных неуникально
Выявление генов и межгенных участков, находящихся на участке генома, с которым индивидуальное прочтение имеет достаточную степень гомологии. Анализ библиотеки CC(ASN)
Подсчет встречаемости конкретного гена/межгенного участка в результатах
аннотирования уникальных последовательностей библиотеки ASN

культуральной среде. Так же, как и в работе (Rachman, Strong et al. 2006), авторами были созданы in silico «белковые сети», объединяющие функционально связанные гены.
В работе Garton et al. было предпринято профилирование экспрессии генов М. tuberculosis, выделенных из мокроты больных туберкулезом (Garton, Waddell et al. 2008). Интерес представляет собой тот факт, что часть (3-86%, 45% в среднем) микобактерий в каждом из образцов мокроты имела липидные включения, делающие их похожими на микобактерии из состояний NRP1 и NRP2 модели нерепликативного состояния Wayne and Hayes (Wayne and Hayes 1996). Авторы также обнаружили, что большая часть генов, чья экспрессия была совместно понижена у микобактерий из двух моделей перепликативного состояния in vitro (33 гена), была также понижена у микобактерий из образцов мокроты (20 из 33 генов). Авторы указывают, что информации для установления того, являются ли бактерии с липидными включениями из образцов мокроты микобактериями в дормантном состоянии, недостаточно. Тем не менее, они делают вывод, что наличие липидных включений у микобактерий из образцов мокроты является характерным для нереплицирующихся бактерий, и что дальнейшее изучение этого феномена может оказаться выгодным для лечения и профилактики туберкулеза.
П. 6. Внутриклеточный транскрннтом М. tuberculosis.
Несмотря на то, что в проведенных исследованиях экспрессии генов М. tuberculosis in vivo были использованы различные экспериментальные модельные объекты, а анализ экспрессии проводился в разных временных точках, можно, тем не менее, выделить ряд основных отличительных черт транскриптома, характерного для микобактерий из внутриклеточного окружения макрофагов. Это, в основном, изменения в экспрессии генов, требующихся для адаптации патогена к неблагоприятным и/или специфическим условиям внутри макрофагов, а также генов различных факторов модуляции иммунного ответа. Микобактерии внутри макрофагов находятся во внутреннем пространстве фагосом, что, наряду с преимуществами, связанными с защитой от компонентов иммунной системы, приводит также и к усложнению доступа патогена к питательным веществам и микроэлементам. Таким образом, изменения в экспрессии генов М. tuberculosis прежде всего направлены на формирование микроокружения, способного поддерживать функциональную активность микобактерий. Ниже приведены изменения в экспрессии генов М. tuberculosis, характерные для пребывания in vivo.