Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции Ca2+-регулируемых фотопротеинов

• Автор: Наташин, Павел Викторович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Биолюминесцентные белки.
Механизм биолюминесцентной реакции
Са2+-регулируемые фотопротеины

Пространственная структура Са -регулируемых фотопротеинов
Особенности пространственной структуры
Са2+-разряженного обелина
Возможные пути формирования
2-гидропероксицелентеразина
Функциональная роль остатков His и Туг в формировании активного фотопротеинового комплекса
Механизм биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов
Механизм биолюминесцентных реакций других целентеразин-зависимых систем
Материалы и методы
Клонирование, олигонуклеотид-направленный мутагенез
Выделение и очистка мутантов фотопротеина обелина Y138F и F88Y
Получение Са2+-разряженных мутантов обелина Y138F и F88Y со связанным целентерамидом
Получение анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса

ГЛАВА
2.5 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и измерение
спектров биолюминесценции
2.6 Измерение спектра поглощения апо-обелин-
целентеразинового комплекса
2.7 Кинетические измерения методом остановленной
струи (stopped-flow)
2.8 Кристаллография
2.9 Программное обеспечение
2.10 Реактивы
3 Пространственные структуры обелина У138Р и
Са2+-разряженного обелина У138Р. Каталитическая функция молекулы воды и роль Тугі38 в биолюминесцентной реакции
3.1 Пространственные кристаллические структуры обелина У138Р со связанным 2-гидроперокси-
целентеразином и Са2+-разряженного обелина У138Р

со связанными целентерамидом и ионами Са
3.1.1 Кристаллизация
3.1.2 Общая структура белков
3.1.3 «ЕР-йапб» Са2+-связывающие петли
3.1.4 Субстрат-связывающие полости
3.1.5 Спектральные и кинетические свойства обелина
У138Р
3.2 Каталитическая функция молекулы воды и роль
Туг! 38 в биолюминесцентной реакции

ГЛАВА
ГЛАВА
4 Пространственные структуры обелина F88Y и
Са2+-разряженного обелина F88Y. Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов
4 Л Пространственные кристаллические структуры
обелина F88Y со связанным 2-гидроперокси-целентеразином и Са2+-разряженного обелина F88Y со связанными целентерамидом и Са2+
4ЛЛ Кристаллизация
4Л .2 Общая структура белков
4Л.З «EF-hand» Са2+-связывающие петли
4Л .4 Системы водородных связей в лиганд-связывающей
полости обелина F88Y до и после
биолюминесцентной реакции
4.2 Структурные основы особенностей спектров
биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов
5 Анаэробный апо-обелин-целентеразиновый комплекс.
Роль His 175 в процессе формирования активного фотопротеина
5.1 Взаимодействие целентеразина с апо-обелином
5.2 Спектры поглощения целентеразина в анаэробных
условиях при различных pH
5.3 Взаимодействие свободного целентеразина
с кислородом
5.4 Спектральные свойства анаэробного апо-обелин-
целентеразинового комплекса. Кинетика превращения апо-обелин-целентеразинового комплекса в активный фотопротеин

конформационных состояниях, а также данных, полученных при исследовании хемилюминесценции и флуоресценции аналогов целентеразина и целентерамида [McCapra et al., 1967; Usami, Isobi, 1996; Shimomura Teranishi, 2000; Imai et al., 2001] была предложена гипотеза (“proton-relay mechanism”) о роли аминокислотных остатков субстрат-связывающей полости в реакции окислительного декарбоксилирования и в формировании эмиттера биолюминесценции фотопротеинов [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].
При исследовании пространственных структур обелина и акворина обнаружено, что в обоих случаях Туг138 связан водородной связью с N1-атомом 2-гидропероксицелентеразина [Head et al., 2000; Liu et al., 2000], однако в Са2+-разряженном обелине этот остаток располагается за пределами субстрат-связывающей полости, и его боковая цепь формирует водородную связь с поверхностным Glu55 [Liu et al., 2006] (рис. 1.5). В разряженном белке Туг138 замещается молекулой воды (W2), которая может служить донором водородной связи для атома азота амидной группы целентеразина.
Усами и Изоби [Usami, Isobe, 1996] в экспериментах по исследованию хемилюминесценции целентеразина в неполярных растворителях, моделирующих окружение связывающей полости фотопротеинов, наблюдали хемилюминесценцию после фотоокисления целентеразина при низких температурах (-78°С). Методом низкотемпературного ядерного магнитного резонанса они определили структуру интермедиата и выяснили, что данное соединение является производным диоксиэтанона. Распад интермедиата с образованием возбужденного состояния нейтрального целентерамида и испусканием света в коротковолновой области спектра (400 нм) наблюдался при более низкой температуре нагревания, нежели хемилюминесценция от возбужденного состояния целентерамид-аниона (475 нм). Следовательно, целентерамид-анион является более стабильным соединением. Из этого авторами был сделан вывод, что декарбоксилирование целентеразина может