Кинетические исследования поверхностных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии

• Автор: Орлова, Дарья Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Содержание
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1. “Лиганд” и “рецептор”. Типы клеточных рецепторов
1.2. Характеристика нейтрофилов. Поверхностные рецепторы
1.3. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд -рецептор на поверхности живых клеток
1.4. Ядро-динамичная среда
1.5. Структура хроматина. Краткое описание
1.6. Белок гетерохроматина НР1
1.7. Экспериментальные методы исследования взаимодействия лиганд-рецептор внутри живых клеток
Глава 2 Материалы и методы
2.1. Сканирующий проточный цитометр
2.2. Пробоподготовка нейтрофилов для измерения на СПЦ
2.3. Проточный цитометр FACS Calibur
2.4. Постановка кинетического эксперимента по исследованию поверхностных лиганд-рецепторных взаимодействий
2.5. Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SP5
2.6. Постановка кинетического эксперимента по исследованию внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий
2.6.1. Плазмиды
2.6.2. Клеточные культуры и трансфекция
2.6.3. Тестовый раствор
2.6.4. FRAP-протокол
Глава 3 Исследование поверхностных лиганд-рецепторных
взаимодействий
3.1. Теория
3.1.1 Формулировка физической модели
3.1.2. Кинетическая схема процесса лиганд-рецепторного связывания
3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения
3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест
3.1.5. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов
3.2. Результаты
3.2.1. Определение абсолютного дифференциального сечения светорассеяния нейтрофила
3.2.1.1. Чувствительность и разрешающая способность СПЦ
3.2.1.2. Оптическая модель и дифференциальное сечение рассеяния нейтрофила
3.2.2. Чувствительность проточного цитометра FACS Calibur
3.2.3. Исследование кинетики лиганд - рецепторного взаимодействия на мембранах нейтрофилов
3.2.4. Определение размера сайта связывания для 1D3 IgM моноклональных
антител на FcyRIIlb рецепторе
3.3. Обсуждение результатов
Глава 4 Исследование внутриклеточных лиганд-рецепторных
взаимодействий

4.1. Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания
4.1.1. Общая формулировка
4.1.2. Кинетическая схема процесса
4.2. Результаты
4.2.1. Разработка нового FRAP метода для неоднородных сред
4.2.2. Апробация метода на простых системах
4.2.2.1. Проверка метода на примере ядер живых клеток
4.2.2.2. Проверка метода на FITC-HSA в растворе глицерин/вода
4.2.2.3. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные позиции области фотовыжигания
4.2.2.4. Проверка метода на GFP-HP1 в ядрах живых клеток, используя различные размеры области фотовыжигания
4.2.3. Исследование мобильности гетерохроматиновых белков
4.3. Обсуждение результатов
Заключение
Выводы
Приложение
Описание сокращений и обозначений
Литература

Введение
Актуальность. Исследование мембранных и внутриклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, клеточной и молекулярной биологии, а также представляет интерес для биофизики в целом.
В настоящее время изучение защитной реакции организма на инфекции (бактериальные, вирусные, грибковые или паразитарные) становится всё более актуальным. Любая макромолекула, чуждая организму, может вызвать защитную реакцию - иммунный ответ. Взаимодействие типа лиганд-рецептор играет ключевую роль в иммунитете, являясь основой распознавания “свой-чужой” на молекулярном и клеточном уровне. Такой тип взаимодействия важен для различных биологических процессов. Например, передача сигналов от окружающей среды клетки в ее внутреннюю часть происходит путём лиганд-рецепотрного взаимодействия белков с сигнальными молекулами. Это играет фундаментальную роль во многих биологических процессах и во многих болезнях (например, таких как рак).
Известно, что все биологические молекулы в клетке - нуклеиновые кислоты, белки и т.д. - синтезируются в строго определенных местах и затем перемещаются к «месту назначения», где они должны выполнить свою специфическую функцию. Перенос макромолекул зачастую происходит за счет диффузии. Однако в сильно неоднородных средах (например, клеточное ядро) процесс диффузии может значительно усложняться наличием обратимого лиганд-рецепторного взаимодействия макромолекул с сайтами связывания. Поэтому для исследований мобильности белков важно совместно рассматривать оба процесса: диффузию и обратимое лиганд -рецепторное взаимодействие.
В последние годы с разработкой новых экспериментальных методов (таких как, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, проточная цитометрия и т.д.) появляется все больше экспериментальных работ, посвященных исследованию мобильности белков и кинетики взаимодействий типа лиганд-рецептор. Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором на поверхности одиночных клеток. Для исследований лиганд-рецепторного взаимодействия внутри живых клеток наиболее широко применяются метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и количественная флуоресцентная лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Однако, для количественных кинетических исследований

Альтернативный подход, развиваемый в данной работе, основан на новом методе обработки видео-FRAP измерений, разрешённых по пространственным координатам и по времени (получаемых с конфокального лазерного сканирующего микроскопа). При этом метод не требует знания соответствующего математического решения исходных дифференциальных уравнений, не зависит от геометрии области выжигания, профиля выжигающего луча лазера и пространственного распределения сайтов связывания.
Разделы “Структура хроматина. Краткое описание” и “Белок гетерохроматина НР1” Главы 1 частично написаны на основе следующего обзора:
Е. Bartova, A. Hamicarova Horakova, R. Uhli'rova, I. Raska, G. Galiova, D. Orlova, S. Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 -403, 2010.