Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм

• Автор: Балобанов, Виталий Александрович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино - Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Модели и подходы, используемые при
изучении процесса сворачивания белков
Сворачивание белков в растворе
Конформационные переходы белка
вблизи поверхности мембраны
1.2 Конформационные состояния белков
Нативное состояние
Развёрнутое состояние
Переходное состояние
Промежуточные состояния
1.3 Характеристика объекта исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Методы, применяемые в работе
Биохимические методы
Экспрессия генов
Выделение и очистка белков
Физические методы исследования
Абсорбционная спектроскопия
Флуоресцентная спектроскопия
Круговой дихроизм (КД)
2.2 Материалы, применяемые в работе
2.3 Приборы, параметры и условия измерений
2.4 Экспериментальные процедуры
Равновесное разворачивание апомиоглобина
и его мутантных форм мочевиной

Равновесное разворачивание апомиоглобина
понижением pH
Равновесная тепловая денатурация апомиоглобина
Равновесное исследование взаимодействия
апомиоглобина с фосфолипидными везикулами
Кинетическое исследование взаимодействия
апомиоглобина с фосфолипидными везикулами
2. 5 Расчет термодинамических параметров
Расчет термодинамических параметров
из равновесного эксперимента
Зависимость стабильности белка от
температуры и концентрации денатуранта
Расчёт параметра Ф для промежуточного состояния
Вычисление видимых констант скоростей процесса взаимодействия апомиоглобина
и его мутантных форм с фосфолипидными везикулами
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Экспрессия генов мутантных форм апомиоглобина.
Выделение и очистка белков
3.2 Построение и анализ диаграмм
термодинамических состояний апомиоглобина
3.3 Исследование влияния точечных мутаций на стабильность нативного и промежуточного состояний
при равновесном разворачивании мочевиной
3.4 Исследование влияния фосфолипидной мембраны
на стабильность апомиоглобина кашалота
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям для большинства белков характерно сворачивание не по принципу «все-или-ничего», при котором накапливаются лишь нативное (N) и развёрнутое (U) состояния, а сворачивание через образование промежуточных (I) состояний, которые проявляются в тех или иных условиях. В присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) белки чаще всего представляют собой практически полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. Более мягкие денатурирующие условия (низкие pH или высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы [Ptitsyn, 1995; Bychkova and Ptitsyn 1993]. Физикохимические свойства таких состояний являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков. Образование таких промежуточных состояний является важным этапом на пути сворачивания белков. Кроме того, с образования таких состояний может начинаться агрегация белка и/или образование им амилоидных структур [Booth et al., 1997; Sharma et al 2010 ]. Можно сказать, что промежуточные состояния являются критическими в сети конформационных состояний белка, и поэтому их всестороннее изучение особенно важно.
Апомиоглобин кашалота является белком, для которого такое состояние наблюдается [Eliezer et al., 1998; Barrick and Baldwin, 1993]. Свойства этого белка достаточно хорошо изучены [Harrison and Blout, 1965; Griko and Privalov, 1994; Eliezer and Wright, 1996; Garcia et al., 2000; Cavagnero et al., 2001; Bertagna and Barrick, 2004]. На пути его сворачивания выделяют нативное, развёрнутое и стабильное промежуточное состояния. Накопление низкотемпературного промежуточного состояния апомиоглобина было показано при разворачивании белка мочевиной или понижением pH. Имеются также косвенные данные, что при температурной

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре 8Ытас1ги КР-5301РС (Япония). Использовали стандартные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Длина волны возбуждающего света была выбрана 293 нм, где триптофановые аминокислотные остатки вносят основной вклад в спектр флуоресценции. Регистрация спектров испускания триптофановой флуоресценции проводилась в интервале 300-500 нм. Рабочая концентрация белка составляла 0.03 мг/мл.
Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на спектрополяриметре МБСО-бОО (Япония). Для измерений КД в дальней ультрафиолетовой (УФ) области использовали кюветы с длиной оптического пути 0.01 см. Молярная эллиптичность [0] вычислялась по формуле
[вЬ=©Х-МВО/1-с,
где 0х - измеряемая величина эллиптичности (в миллиградусах) на длине волны X; МВО - средний молекулярный вес остатка, вычисленный из аминокислотной последовательности; 1 - длина оптического пути (длина кюветы в миллиметрах); с - концентрация белка в мг/мл. Рабочая концентрация белка составляла 1 мг/мл.
2.4 Экспериментальные процедуры
Равновесное разворачивание апомиоглобина и его мутантных форм мочевиной.
Для проведения экспериментов по равновесному разворачиванию структуры белка мочевиной, растворы белка готовились в буфере без мочевины и в буфере с концентрацией мочевины 8 М (0.03 мг/мл для измерения флуоресценции и 1 мг/мл для измерения КД). Для получения конечных концентраций мочевины от 0.0 М до 8.0 М приготовленные исходные растворы смешивались в различных пропорциях. Для установления равновесия между разными конформационными состояниями белка