Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster

• Автор: Четверина, Дарья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Список используемых сокращений ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы Цель и задачи исследования
Научная новизна и практическая ценность работы
Апробация работы
Публикации
Благодарности

10 10
ГЛАВА I. Роль инсуляторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II у D.melanogaster (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)
1. Цис-действующие регуляторные последовательности генов,
транскрибируемых РНК-полимеразой II
1.1. Базальный промотор
1.2. Энхансеры
1.3. Сайленсеры
1.4. Инсуляторы
2. Характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster
2.1. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs1)
2.2. 8и(Ну)-содержащие инсуляторы
2.2.1. Su(Hw)-HHcynaTop
2.2.2. 1А2-инсулятор
2.2.3. Другие 8и(Ну)-связывающие инсуляторы
2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена
2.3.1. Fab7
2.3.2. МСР
2.3.3. Fab8

2.4. Инсулятор IdefixU3
2.5. Инсулятор Fdwh
2.6. Инсулятор SF1
3. Модели энхансер-блокирующей активности инсуляторов
3.1. Структурные модели
3.2. Транскрипционные модели
3.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Генетичсские методы
1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе
1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение
трансгенных линий
1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в
трансгенных линиях
1.4. Генегические скрещивания
2. Биохимические методы
2.1. Работа с бактериальной линией E.coli DH5a
2.1.1. Среды для культивирования
2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии E.coli DIT5a
2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии
E.coli DH5a
2.2. Методы работы с ДНК
2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК
2.2.2. Определение концентрации ДНК
2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК
2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a
2.2.6.1 .Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC74
2.3. Саузерн-блот-анализ
2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы
2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы
2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы
2.5. Трансфекция клеток S2 Drosophila и анализ активности люцифераз
2.6. Метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA,
Electrophoretic Mobility Shift Assays)
2.6.1 .In vitro транскрипция - трансляция
2.6.2. Подготовка фрагментов ДНК
2.6.3. Связывание ДНК-фрагментов с Su(Hw)-6enKOM
2.6.4. Связывание ДНК-фрагментов с dCTCF-белком
2.6.5. Вертикальный полиакриламидный гель-электрофорез
3. Создание трансгенных конструкций
3.1. Конструкции для тестирования фрагмента длиной 825 п.н. на энхансерблокирующую активность
3.2. Конструкции для тестирования влияния Wari-инсулятора на
активности других инсуляторных элементов

Постулируется, что каждый домен является отдельной единицей организации хроматина, и гены каждого из доменов находятся под контролем лишь тех энхансеров, которые присутствуют в одном с ними домене. Как следствие, энхансер одного домена не может активировать промотор гена, находящегося в другом домене (рис. 13).
Как было сказано в предыдущем разделе, энхансер-блокирующая активность 8и(Ну)-инсулятора зависит от одноименного белка Su(Hw). Su(Hw) белок в свою очередь взаимодействует с белком Mod(Mdg4)-67.2 и с белком СР190. Этот комплекс также взаимодействует с предполагаемым четвертым белковым компонентом инсулятора - белком dTopors.
Для Su(Hw)-HHcynaTopoB была экспериментально продемонстрирована способность к формированию оснований хроматиновых петель (Byrd and Corces, 2003), было показано, что в диплоидных ядрах белки Su(Hw), Mod(mdg4)-67.22 и СР190 собраны в 15-20 видимых ядерных телец («спеклы»), а белок dTopor взаимодействует с белками ядерной оболочки (Capelson and Corces, 2005). Это дало основание предложить модель, по которой индивидуальные сайты связывания белка Su(Hw), локализованные в различных частях хромосом, приближены друг к другу посредством белков инсуляторного комплекса, что приводит к формированию структур, подобных розетке, которые были названы «инсуляторными тельцами» (Gerasimova and Corces, 1998; Pai et al;., 2004; Capelson and Corces, 2005). Утверждается, что домены, организованные посредством этого механизма, разграничивают энхансер и промотор, мешая их взаимодействию. Главная роль отдается формированию петли посредством Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов; локализация «инсуляторных телец» внутри ядра может иметь меньшее значение (Gaszner and Felsenfeld, 2006).
Более того, недавно был обнаружен новый белковый компонент dCTCF-связывающих инсуляторов. Оказалось, что им является белок СР190 инсуляторного комплекса 8и(Ну)-зависимых инсуляторов, хотя сайты связывания белков dCTCF и Su(FIw) на политенных хромосомах не