Взаимодействие аденовирусных онкопротеинов с клеточным белком AUP1 человека

• Автор: Карпишева, Ксения Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 156 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
I. Общая характеристика аденовирусов.
II. Инфекционный цикл аденовируса.
III. Трансформация клеток, вызванная аденовирусной инфекцией.
IV. Четвертый ранний район аденовируса.
1.E40RF1
2. E40RF2
3. E40RF3/4
4. E40RF4
5. E40RF6/7
6. E40RF3 и E40RF6
V. Белок AUP1
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I. Клеточные линии.
II. Бактериальные штаммы.
III. Плазмиды, использованные в работе.
IV. Анализ взаимодействия белков in vitro.
V. Трансфекция клеток.
VI. Инфекция клеточных культур аденовирусом.
VII. Получение поликлональных антител к Аир I

VIII. Иммунофлуоресценция.
IX. Вестерн-блот и иммуноприципитация.
РЕЗУЛЬТАТЫ
I. Клонирование полной последовательности кДНК гена AUP1 человека и сравнение
ее с геномной копией.
1. Идентификация Аир 1.
2. Клонирование полной последовательности кДНК гена Лир] человека.
3. Геномная организация гена Aupl человека.
4. Определение молекулярной массы in vitro транслированного белка AUP1.
И. Исследование in vitro взаимодействия белка AUP1 с E40RF3 и с другими
вирусными белками.
1. Взаимодействие белка AUP1 с E40RF3.
2. Локализация сайтов взаимодействия белков AUP1 и E40RF3.
3. Исследование in vitro взаимодействия белка AUP1 с аденовирусными 107 белками E40RF6, ElB55kDa, E40RF4/6 и PML, маркером POD.
III. Изучение внутриклеточной локализации белка AUP1.
1. Изучение локализации эндогенного и экзогенного белка AUP1 в различных
клеточных линиях человека и крысы.
2. Изучение локализации белка AUP1 в процессе аденовирусной инфекции.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Изучение процессов приводящих к трансформации клетки является одним из приоритетных направлений современной клеточной биологии. Одной из моделей позволяющей выявить механизмы преобразований происходящих в клетке является трансформация клеток с помощью вирусных онкопротеннов, в том числе имеющих аденовирусное происхождение.
В настоящее время аденовирусы являются одними из излюбленных модельных объектов не только в вирусологии, но и в клеточной биологии (Chinnadurai, 1998). Это связано, прежде всего, с относительной простотой и удобством работы с этими вирусами и их геномом, легко поддающимся манипуляциям. Изучение аденовирусов актуально как с точки зрения фундаментальной науки, так и медицины, так как они представляют собой уникальную модельную систему для изучения регуляции синтеза ДНК, клеточной пролиферации, трансформации и апоптоза (Dyson and Harlow, 1992, Morgan, 1993, White and Gooding, 1994, Theodoro and Branton, 1997, Lavoie et al., 2000). Помимо этого, использование аденовирусов как модельных объектов для изучения молекулярных основ биологии вируса и клетки позволило описать явление сплайсинга иРНК. (Shenk, 1996). Первыми вирусами человека, для которых была описана способность вызывать образование злокачественных опухолей грызунов in vivo, также были аденовирусы (Takemori et al., 1968). Отдельную область исследования представляет большое количество работ посвященных аденовирусам, как одному из наиболее перспективных векторов, используемых в генной терапии (Brough et al., 1997, Ramalingam et al., 1999a, Christ et al., 2000).

4. E40RF
Для нормального протекания аденовирусной инфекции в клетках человека, необходимо комплексное взаимодействие между индукцией и супрессией различных путей программируемой клеточной гибели (Roulston et al., 1999). Белки первого аденовирусного района являются индукторами как р53 зависимого, так и р53 не зависимого механизмов развития апоптоза (Teodora et al., 1995). Анализ развития вирусной инфекции в р53 негативных клетках показал, что развитие р53-независимого апоптоза происходит из-за трансактивации E40RF4, непосредственного индуктора этого процесса (Marcellus et al., 1996, Marcellus et al., 1998).
E40RF4, как большинство продуктов четвертого раннего района, мультифункциональный белок. Он регулирует уровень транскрипции как клеточных, так и вирусных белков, модулирует активность и функции некоторых из них и запускает р53-независимый апоптоз (Shitrichman et al., 1999).
E40RF4 является функциональным антогонистом для E40RF3 и E40RF6. Гиперэкспрессия E40RF4 приводит к нарушению уровней репликации и накопления вирусной ДНК. При инфецировании различных клеточных линий аденовирусами с делецией по E4orf3 и E4orf6 генам, но содержащим E4orf4 дикого типа наблюдается аналогичный эффект: резкое снижение уровней репликации и накопления вирусной ДНК. Трансфекция в клетки, инфицированные подобным вирусом, плазмиды содержащей ген E4orf3 или E4orf6, или плазмиды содержащей оба этих гена, приводит к востановлению нормальных уровеней репликации вирусной ДНК и ее укладки.