Регуляция эндоцитоза рецепторов эпидермального фактора роста

• Автор: Корнилова, Елена Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 282 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Общие принципы функционирования рецепторных тирозинкиназ
Структура РТК
Активация РТК
Механизм активации сигнальных белков
Внутриклеточные сигнальные пути
Механизмы регуляции сигнала
Рецептор ЭФР - член семейства рецепторных киназ егЬВ
Структура эпидермального фактора роста и его рецептора
Лиганды и рецепторы семейства егЬВ
Аффинность рецептора ЭФР
Пути диверсификации сигнала, стимулируемого рецептором ЭФР
Механизмы регуляции везикулярного транспорта
Белки окаймления
Регуляция слияния мембран
ПСБ-ЭМАР-ЗМАНЕ комплексы
РаЬ-белки и их эффекторы
Функции ІРаЬ-белков
Роль липидов в регуляции транспортной функции мембран
Фосфатидилинозитол-З-киназы
Убиквитинирование и везикулярный транспорт
Роль цитоскелета в регуляции везикулярного транспорта
Эндоцитоз
Общие представления об эндоцитозе
Компартменты эндоцитозного пути
Рецептор-опосредованный эндоцитоз ЭФР
Молекулярные аспекты функционирования эндосом. Принцип
мозаичности
Эндоцитоз и передача сигнала
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные линии

3.2. Лиганды и их производные
3.2.1. Получение ЭФР и его производных
3.2.2 Иодирование лигандов
3.3. . Исследование динамики эндоцитоза ЭФР
3.3.1. Стимуляция эндоцитоза по схеме с предварительным связыванием
лиганда
3.3.2. Стимуляция эндоцитоза по схеме "импульсной" загрузки лигандов
3.3.3. Определение степени деградации лиганда
3.3.4. Рециклирование ЭФР
3.4. Субклеточное фракционирование
3.4.1. Фракционирование органелл в градиентах плотности Перколла
3.4.2. Очистка фракций на градиенте сахарозы
3.5. Обработка результатов экспериментов по динамике эндоцитоза с
применением меченых лигандов
3.6. Фосфорилирование материала фракций
3.7. Электронно-микроскопические исследования фракций
3.8. Обработка клеток ингибиторами
3.9. Анализ популяции поверхностных рецепторов методом Скэтчарда
3.10. Исследование распределения клеток по фазам клеточного цикла с
помощью проточной флюорометии
3.11. Исследование включения 14С-тимидина в ДНК клеточных ядер
3.12. Антитела
3.13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
3.14. Иммунопреципитация
3.15. Электрофорез
3.16. Иммуноблоттинг
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Характеристика основных компартментов эндоцитозного пути ЭФР-
рецепторных комплексов
4.1.1. Идентификация эндоцитозных компартментов
4.1.2. Морфология фракций, содержащих ЭФР
4.1.3. Состояние рецептора ЭФР в эндосомах
4.2. Рециклирование ЭФР-рецепторных комплексов
4.3. Внутриклеточный процессинг рецепторов ЭФР с различной аффинностью

3.2. Лиганды и их производные
3.2.1. Получение ЭФР и его производных
3.2.2 Иодирование лигандов
3.3. . Исследование динамики эндоцитоза ЭФР
3.3.1. Стимуляция эндоцитоза по схеме с предварительным связыванием
лиганда
3.3.2. Стимуляция эндоцитоза по схеме "импульсной" загрузки лигандов
3.3.3. Определение степени деградации лиганда
3.3.4. Рециклирование ЭФР
3.4. Субклеточное фракционирование
3.4.1. Фракционирование органелл в градиентах плотности Перколла
3.4.2. Очистка фракций на градиенте сахарозы
3.5. Обработка результатов экспериментов по динамике эндоцитоза с
применением меченых лигандов
3.6. Фосфорилирование материала фракций
3.7. Электронно-микроскопические исследования фракций
3.8. Обработка клеток ингибиторами
3.9. Анализ популяции поверхностных рецепторов методом Скэтчарда
3.10. Исследование распределения клеток по фазам клеточного цикла с
помощью проточной флюорометии
3.11. Исследование включения 14С-тимидина в ДНК клеточных ядер
3.12. Антитела
3.13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
3.14. Иммунопреципитация
3.15. Электрофорез
3.16. Иммуноблоттинг
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Характеристика основных компартментов эндоцитозного пути ЭФР-
рецепторных комплексов
4.1.1. Идентификация эндоцитозных компартментов
4.1.2. Морфология фракций, содержащих ЭФР
4.1.3. Состояние рецептора ЭФР в эндосомах
4.2. Рециклирование ЭФР-рецепторных комплексов
4.3. Внутриклеточный процессинг рецепторов ЭФР с различной аффинностью

Трискелион состоит из 3 тяжелых (180 кДа) и трех легких (33 или 36 кДа) цепей клатрина. Каждая тяжелая цепь взаимодействует с легкой через свою С-концевую часть, и 3 С-терминальные конца тяжелых цепей взаимодействуют друг с другом. Трискелионы обладают способностью к самосборке in vitro и образуют полигональные решетки на цитоплазматической стороне мембран in vivo (Kirchhausen, Harrison, 1981; Unanue et al, 1981). Предполагается, что клатриновая решетка собирается вначале на относительно плоском участке мембраны и состоит в основном из гексагонов. По мере образования инвагинации и затем пузырька некоторые гексагоны реогранизуются в пентагоны, и в окончательном варианте окаймленная везикула содержит 12 пентагонов и различное число гексагонов (Crowther, Pearse, 1981). Механизм такой реогранизации неизвестен, однако предполагают, что она может служить движущей силой при искривлении мембраны, хотя не исключено, что появление пентагонов есть не причина, а следствие изменений в липидном бислое (Cupers et al., 1994),
Между клатриновой решеткой и мембраной располагаются адапторные комплексы АР. К настоящему моменту идентифицированы четыре типа AP: АР1 и АРЗ локализуются на мембранах транс-Гольджи и опосредуют разные транспортные пути в поздние эндосомы и лизосомы, АР2 участвуют в регуляции интернализации рецепторов на плазматической мембране, точная локализация (и функция) АР4 неизвестны (Jarousse, Kelly, 2000). Интересно, что хотя все AP-комплексы характеризуются значительной гомологией, АРЗ-окаймление не нуждается в клатрине (Simpson et al., 1996). Адапторные комплексы АР1, АР2, АРЗ и АР4 состоят из четырех белков: двух больших (-100 кДа), называемых адаптинами (y/a/5/s и ß 1 / ß2/ ß3/ ß4, соответственно) , среднего (д1-д4, -50 кДа) и маленького (ст1-ст4, ~20кДа), каждый из которых существует в виде нескольких изоформ (Jarousse, Kelly, 2000). Степень гомологии ß-, д- и ст-субъединиц различных комплексов весьма высока, тогда как у-, а-, 8- и s-адаптины менее гомологичны между собой. Интересно, что субъединицы AP-комплексов и компоненты COP-l-окаймления ß- , у- , 5- и С-СОР имеют общее происхождение (Takatsu et al., 2001). Многочисленные исследования позволили определить роль каждой субъединицы. Так, а- и гомологичные ему адаптины существенны для правильной локализации каждого AP-комплекса на соответствующей мембране, а также способны связывать клатрин; ß-адаптины обеспечивают взаимосвязь с клатрином, с одной стороны, и рецепторами-грузами, с другой. Основная функция д-субъединиц заключается в селективном взаимодействии с рецепторами-грузами. Роль маленьких субъединиц до конца неясна, но существуют