Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей

• Автор: Арляпов, Вячеслав Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 189 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов
1.1.1. Современная концепция биосенсоров
1.1.2. Биосенсоры на основе микробных клеток
1.1.3. Особенности строения и метаболизма бактерий аисопоЬааег охубат и перспективы их применения в микробных сенсорах
1.1.4. Особенности биохимии дрожжевых клеток
1.1.4.1. Общая характеристика метилотрофных дрожжей Р1сМа а)щивШ и метилотрофного обмена
1.1.4.2. Характеристика дрожжей Агхи1а абептоуогат
1.1.5. Методы иммобилизации клеток микроорганизмов
1.1.5.1. Физические и химические методы иммобилизации клеток
1.1.5.2. Иммобилизация клеток путем включения клеток в массу носителя
1.2. Биосенсоры для определения биохимического потребления кислорода
1.2.1. Методы анализа ВПК
1.2.2. Метод определения БПК с использованием биосенсора
1.3. Обработка данных систем биосенсоров
1.3.1. Методы, применяемые для обработки экспериментальных данных систем биосснсоров
1.3.2. Искусственные нейронные сети
1.3.2.1. История развития теории нейронных сетей
1.3.2.2. Структура, свойства и виды ИНС
1.3.2.3. Обучение ИНС
1.3.2.4. Применение ИНС для решения задач, связанных с исследованием и разработкой сенсорных систем
1.4. Заключение
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы
2.2. Культивирование клеток микроорганизмов
2.3. Иммобилизация биомагермала и формирование электрода
2.3.1. Иммобилизация клеток микроорганизмов адсорбцией на стекловолоконном фильтре
2.3.2. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в поперечно-сшитый бычин сывороточный альбумин (БСА)
2.3.3. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в полиакриламидный гель (ПААГ)
2.3.4. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в гель ПВС, полученный
УФ-облучением
2.3.5. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в криогель ПВС
2.3.6. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в агаровый гель
2.4. Биосснсорные измерения
2.4.1 Кюветный способ регистрации сигнала
2.4.2 Проточно-инжекционный способ регистрации сигнала
2.5. Математическая обработка данных
2.6. Хроматографические измерения
2.6.1. Газовая хроматография

2.6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Иммобилизация микроорганизмов для получения рецепторных элементов биосенсоров
3.1.1. Получение стабильных рецепторных элементов биосенсора на основе различных способов иммобилизации клеток микроорганизмов
3.1.1.1. Иммобилизация клеток микроорганизмов адсорбцией на стекловолоконном фильтре
3.1.1.2. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в ПЛАГ
3.1.1.3. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в гель ПВС
3.1.1.4. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в гель БСА
3.1.1.5. Иммобилизация клеток микроорганизмов включением в агаровый гель
3.1.2. Субстратная специфичность разработанных рецепторных элементов
3.1.3. Операционная стабильность биосенсора на основе разработанных биорецепторных элементов
3.1.4. Долговременная стабильность биосенсоров на основе разработанных биорецепторных элементов
3.1.5. Чувствительность и нижняя граница определяемых концентраций биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов
3.1.6. Экспрессность биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов
3.1.7. Заключение
3.2. Разработка макета биосенсорпого анализатора, модифицированного для экспресс-определения БПК
3.2.1. Субстратная специфичность рецепторных элементов биосенсора
3.2.2. Влияние pH на чувствительность биорецепторов
3.2.3. Определение параметров градуировочных зависимостей биосенсоров
3.2.4. Определение характеристик разработанного макета биосенсора
3.2.5. Анализ образцов сточных вод и полупродуктов брожения
3.2.6. Хроматографический анализ образцов сточных вод и полупродуктов брожения
3.3. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах
3.3.1. Анализ двухкомпонентных смесей этанол-глюкоза
3.3.1.1. Получение массива данных для обучения и тестирования ИНС
3.3.1.2. Оптимизация параметров ИНС
3.3.1.3. Определение состава модельных смесей с использованием ИНС оптимальной конфигурагрш
3.3.2. Анализ двухкомпонентных смесей метанол-этанол
3.3.2.1. Получение массива данных для обучения и тестирования ИНС
3.3.2.2. Определение состава модельных смесей с использованием ИНС оптимальной конфигурации
3.3.3. Анализ трехкомпонентных смесей метанол-этанол-глюкоза
3.3.3.1. Получение массива данных для обучения и тестирования ИНС
3.3.3.2. Оптимизация параметров ИНС
3.3.3.3. Использование ИНС с одним выходом
3. 3.3.4. Определение состава модельных смесей с использованием ИНС оптимальной конфигурации
3.3.4. Анализ четырехкомпонентных смесей метанол-этанол-глюкоза-фруктоза
3.3.4.1. Получение массива данных для обучения и тестирования ИНС
3.3.4.2. Оптимизация параметров ИНС

3.3.4.3. Определение состава модельных смесей с использованием ИНС
оптимальной конфигурации
3.3.5. Определение состава образцов алкогольсодержащей продукции
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии стоков ОАО «ГПК Ефремовский»
Приложение 2. Результаты газовой хроматографии стоков ОАО «ГПК Ефремовский»
Приложение 3. Данные анализа образцов алкогольсодержащей продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Приложение 4. Данные анализа образцов алкогольсодержащей продукции методом газовой хроматографии

Иммобилизация клеток микроорганизмов в гели 1-го рода, получаемые сшиванием полимерных предшественников, отличается от поли(олиго)мерных диизоцианатов и полиэпоксидов тем, что реакциониоспособные группировки, по которым идет сшивка, находятся не только на концах макромолекулы предшественника, а распределены по всей длине полимерной цепи.
Здесь наиболее очевидный и поэтому давно реализованный вариант - включение микробных клеток в гель на основе белков, сшиваемых альдегидами. В качестве полимерного предшественника в этом случае используются такие доступные вещества, как: желатин, сывороточный альбумин и даже белок куриного яйца [48, 58].
Удобно, что растворы желатина можно перед использованием стерилизовать автоклавированием, так как при этом свойства данного белка практически не изменяются. Однако, поскольку достаточно концентрированные растворы желатина (>5%) быстро студенеют при температурах ниже 40°С, то все манипуляции с ними требуется проводить быстро, до момента достижения гель-точки; при работе с термолабильными культурами иммобилизируемых клеток это тем более необходимо.
Сывороточный альбумин или белок куриного яйца при нагревании термокоагулируют, поэтому для их растворов возможны только методы холодной стерилизации. Зато эти белки при комнатной температуре в отсутствие кросс-агентов не желируют. Соответственно, диспергирование клеток в растворе альбумина или яичного белка по времени не ограничивается.
Так же, как и для других видов иммобилизации клеток включением в массу полимерного геля, определенными достоинствами обладают формируемые из желатины [59] или сывороточного альбумина [60] макропористые сшитые белковые криогели. Получаемые мягкие носители обеспечивают хорошие диффузионные возможности субстратам и метаболитам, создают приятное для иммобилизированных структур «белковое» микроокружение.
Наряду с ковалентно-сшитыми белковыми матрицами часто применяются гелевые носители, получаемые сшивкой других высокомолекулярных соединений (полисахариды, синтетические полимеры). Довольно популярен метод включения клеток в гидрогель, образующийся при взаимодействии гидразинового производного акриламида с