Изучение механизма ферментативного карбоксилирования 5-аминоимидазолриботида

• Автор: Трибунских, Илья Александрович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 114 с. : ил.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика карбоксилаз
1.2. Эндоэргические реакции карбоксилирования, катализируемые карбоксилазами первого типа
1.2.1. Структура и механизм действия карбамоилфосфатсинтетаз
1.3. Экзоэргическое карбоксилирование
1.3.1. Структура и механизм действия рибулозобисфосфат-карбоксилаз/оксигеназ
1.4. Общая характеристика биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo и АИР-карбоксилаз, участвующих в этом биосинтезе
1.4.1. Явление С02-стимуляции
1.5. Химический синтез субстратов АИР-карбоксилазы и их
аналогов
1.6. Изучение обратимой реакции неферментативного
карбоксилирования
1.7. Сравнительная характеристика АИР-карбоксилаз бактерий, грибов и высших эукариот
1.7.1. Ферменты бактерий
1.7.2. Ферменты архебактерий
1.7.3. Ферменты грибов
1.7.4. Ферменты высших эукариот
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Приборы
2.2. Реактивы
2.3. Методы исследования
2.3.1. Спектрофотометрические методы
2.3.2. Использование спектроскопии ЯМР 'Н для изучения реакции
обратимого превращения АИР -» КАИР
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Химический синтез субстратов АИР-карбоксилазы
3.2. Характеристика АИР-карбоксилазы дрожжей Saccharomyces
cerevisiae и САИКАР-синтетазы-АИР-карбоксилазы человека
3.3. Изучение кинетики неферментативного декарбоксилирования 5-амино-4-карбоксиимидазолриботида и 5-амино-4-карбокси-1метилимидазола с помощью УФ- и ’Н-ЯМР-спектроскопии
3.4. Изучение кинетики неферментативного карбоксилирования 5-амино-имидазолриботида и аминометилимидазола с помощью УФ-спектроскопии
3.5. Изучение кинетики ферментативного декарбоксилирования 5-амино-4-карбоксиимидазолриботида с помощью УФ- и ЯМР 'Н-спектроскопии
3.6. Изучение кинетики ферментативного карбоксилирования 5-аминоимидазолриботида с помощью УФ- и ЯМР 'Н-спектроскопии
3.7. Исследование мутантных и модифицированных форм АИР-карбоксилазы дрожжей
3.8. Эволюция фермента АИР-карбоксилазы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ
приложение 5
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
А1 - оптическая плотность при определенной длине волны АДФ - аденозин-5 ’-дифосфат
АИКАР - 5-амино-4-карбоксамидоимидазолриботид; моно-(ЗИ, 4И, 5Я)-[5-(5’-амино-4’-карбамоил-имидазолил-Г)-3, 4-дигидрокси-тетрагидрофуранил-2]-метиловый эфир фосфорной кислоты
АИКАР3 -5-амино-4-карбоксамидоимидазолрибозид; амид (2’Я, З’И, 4’И)-5-амино-1-(3’, 4’-дигидрокси-5’-гидроксиметил-тетрагидрофуранил-2’)-1Н-имидазол-4-карбоновой кислоты
АИР - 5-аминоимидазолриботид; моно-(ЗИ, 411, 511)-[5-(5’-амино-имидазолил-1’)-3, 4-дигидрокси-тетрагидрофуранил-2]-метиловый эфир фосфорной кислоты
АМФ - аденозин-5’-монофосфат АТФ - аденозин-5’-трифосфат АцКоА - ацетилкофермент А
Б1, Б2, БЗ - соответственно 0,06 М, 0,27 М и 0,5 М трис-фосфатные буферные растворы с pH 8,0 с
ГАР — фосфорибозилглицинамид; моно-(ЗЯ, 4И, 5Я)-[5-(2’-амино-ацетила-мино)-3, 4- дигидрокси-тетрагидрофуранил-2]-метиловый эфир фосфорной кислоты
ГМФ - гуанозин-5’-монофосфат ГТФ - гуанозин-5’-трифосфат ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия
ДСН-электрофорез - денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле ДТТ - дитиотреитол
ддАТФ -2’, 3’-дидезоксиаденозин-5’-трифосфат 2’-дАТФ - 2’-дезоксиаденозин-5’-трифосфат

бактериальной САИКАР-синтетазой, С-концевой домен гомологичен ферменту Ei бактерии E. coli; в геноме позвоночных животных не обнаружено нуклеотидных последовательностей, гомологичных последовательности гена РигК бактерии E. coli [66, 76]. Авторами показано, что N-КАИР не является субстратом для этого фермента; так же он не катализирует реакцию АИР с НСОз', сопряженную с гидролизом АТФ до АДФ. В то же время фермент осуществляет прямое С-карбоксилирование АИР молекулой ССЬ (Км = 0,8 мМ) и ускоряет обратный процесс - декарбоксилирование КАИР непосредственно в АИР и СО2, что подтверждено спектроскопией ЯМР ]Н. Катионы магния в концентрации 25 мМ увеличивают скорость карбоксилирования АИР в 1,5 раза по сравнению с опытом, в котором реакционная смесь их не содержит. В аналогичных условиях скорость декарбоксилирования уменьшается в 10 раз. Исследователи объяснили полученные результаты тем, что КАИР образует с магнием, как и с другими двухвалентными катионами, комплекс, который растворим, и является субстратом для САИКАР-синтетазы, но не для АИР-карбоксилазы курицы. Потеря ферментом активности САИКАР- синтетазы на 90 % и 10 % инактивация АИР-карбоксилазы при двухчасовой инкубации с 5’-[(4-фторосульфонил)-бензоил]-аденозином (ФСБА) указывают на наличие двух активных центров и их относительную независимость (инактивацию карбоксилазы авторы объяснили неспецифическим связыванием). Еще одним доказательством этого утверждения стали результаты проверки ингибиторных свойств 5-амино-4-нитро-имидазолриботида. Он оказался очень сильным ингибитором декарбоксилазной активности (КИ - 0,34 нМ). Значительная разница между константами ингибирования для АИР-карбоксилаз из печени курицы и бактерий, по мнению исследователей, обусловлена большими структурными изменениями, произошедшими в процессе их эволюции (гомология по аминокислотной последовательности достаточно низкая - 26 %) [66].
Частично был охарактеризован фермент, выделенный из эритроцитов человека. В работе [77] в основном приведены данные о его выделении и очистке.