Генетическая инженерия коммерческих сортов картофеля

• Автор: Стародубцева, Анастасия Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с. : ил

Оглавление
Список иллюстраций
Список сокращений
1. Актуальность проблемы
2. Цели и задачи работы
3. Научная новизна
4. Обзор литературы
4.1. Трансформация растений сегодня
4.2. Регенерация. Культивирование тканей
4.3. Системы трансформации
4.3.1. Трансформация протопластов
4.3.2. Баллистическая трансформация
4.3.3. Агробактериальная трансформация
4.3.4. Альтернативные методы
4.4. Селекция и маркеры
4.5. Внедрение трансгенов и улучшение экспрессии
4.6. Перспективы
4.7. Взаимодействие между растением и агробактерией
4.7.1. Введение
4.7.2. Взаимодействие «клетка-клетка». Распознавание на клеточном
уровне
4.7.3. Сигналы трансдукции и активация транскрипции vir-генов
4.7.4. Элементы Т-ДНК
4.7.5. Переносимая T-цепь. Процессинг Т-ДНК
4.7.6. Структурная модель транспорта Т-ДНК. Т-комплекс
4.7.7. Межклеточный транспорт
4.7.8. Ядерный импорт..!
4.8. Картофель как объект генно-инженерных манипуляций
4.8.1. Эффективность трансформации и фенотипическая вариабельность трансгенных растений
4.8.2. Создание картофеля, устойчивого к вредителям и болезням
4.8.3. Картофель, устойчивый к абиотическим стрессам
4.8.4. Процессы развития
4.8.5. Применение молекулярных подходов в сельском хозяйстве
4.9. Факторы, влияющие на эффективность трансформации
4.9.1. Бактериальный штамм и генотип растения
4.9.2. Тип экспланта
4.9.3. Оптимальные условия со-культивирования
4.9.4. Селекция
4.9.5. Регенерация и реакция на стрессовое воздействие
4.10. Компоненты питательных сред как факторы, влияющие на эффективность трансформации
4.10.1. Микро- и макроэлементы
4.10.2. Витамины
4.10.3. Антибиотики
4.10.4. Гормоны
4.10.5. Ауксины
4.10.6. Цитокинины
4.10.7. Ауксин-цитокининовое взаимодействие
4.10.8. Гиббереллины
4.10.9. Абсцизовая кислота
4.10.10. Этилен
4.10.11. Сроки и продолжительность применения

4.10.12. Заключение
5. Материалы и методы
5.1. Сорта картофеля, используемые в работе
5.2. Реактивы, использованные при проведении работы
5.3. Методы ведения культуры in vitro
5.3.1. Получение и размножение растений картофеля в культуре in
vitro
5.3.2. Среды, использованные в работе для поддержания растений
культуры in vitro и трансформационного процесса
5.3.3. Состав и методика приготовления компонентов питательных

5.3.4. Индукция каллусообразования и морфогенеза в культуре in
vitro
5.3.5. Среды для инициации морфогенеза каллуса
5.3.6. Регенерация растений из морфогенного каллуса
5.4. Культура агробактерии
5.4.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
5.4.2. Состав и способы приготовления среды для культивирования
агробактериальных штаммов
5.4.3. Хранение агробактериальных штаммов
5.4.4. Наращивание агробактерииальной культуры для трансформации
5.5. Трансформация и селекция
5.5.1. Методика отмывки эксплантов
5.5.2. Варианты со-культивации
5.5.3. Определение оптимальной концентрации селективных агентов
5.5.4. Протокол трансформации
5.6. Статистический анализ
5.6.1. Дисперсионный анализ однофакторного опыта
5.6.2. Наименьшая существенная разница
5.7. Методика выделения ДНК
5.8. Методика проведения ПЦР
5.9. Анализ продуктов ПЦР
5.10. Иммунофермеитный анализ белка тауматин II
6. Результаты и их обсуждение
6.1. Разработка эффективной системы трансформации
коммерческих сортов картофеля
6.1.1. Изучение регенеративной способности различных типов
эксплантов
6.1.2. Изучение влияния состава питательной среды на процессы
каллусообразования и регенерации
6.1.3. Определение оптимального срока начала применения гиббереллина в питательной среде для регенерации
6.1.4. Изучение влияния различных способов подготовки
агробактериальных штаммов на эффективность
трансформации
6.1.5. Изучение влияния различных типов со-культйвации на
эффективность трансформации
6.2. Селекция трансформированных тканей и регенерация
растений
6.3. Оптимизация протокола трансформации для каждого сорта
6.4. Траисгенные растения сортов Луговской, Невский и
Голубизна, экспрессирующие ген Ваг, обеспечивающий устойчивость к глюфосинату натрия

6.4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений картофеля при помощи ПЦР-анализа
6.4.2. Адаптация растений культуры in vitro к почвенным условиям
6.4.3. Ограниченные полевые испытания в условиях открытого
грунта 2000 год
6.4.4. Ограниченные полевые испытания в условиях открытого
грунта 2001 год
6.5. Трансгенные растения сортов Луговской, Голубизна и
Чародей, экспрессирующие ген белка тауматин II
6.5.1. Выявление наличия гена taull в геноме растений картофеля
при помощи ПЦР-анализа
6.5.2. Полевые испытания в условиях закрытого грунта
6.5.3. Адаптация растений культуры in vitro к почвенным условиям
с использованием гидропонной установки «Минивит-2»
6.5.4. Ограниченные полевые испытания в условиях открытого
грунта
7. Выводы
8. Список литературы
Обзор литературы

ся только во время полевых испытаний. Эти данные подтверждают тот факт, что вариабельность сортоспецифична (включая сомаклональную вариабельность), а также то, что тепличные испытания не заменяют полевых (по крайней мере, для коммерческих характеристик) и, что невозможно предсказать реакцию растения (как носителя хозяйственно- ценных признаков) на интеграцию и экспрессию вводимых генов.
Dale&Hampson [1995] протестировали на эффективность трансформации 34 сорта, используя протокол трансформации, разработанный для клубневых дисков сорта Desiree (в Европе сорт Desiree обычно используется для фундаментальных исследований, связанных с экспрессией генов.). Только половина сортов регенерировала, и из этих регенерантов едва ли не один соответствовал характеристикам исходного сорта. Некоторые сорта, которые не регенерировали из клубневых дисков, успешно регенерировали, когда в качестве эксплантов использовали листья или стеблевые сегменты. Экспланты отдельных сортов не регенерировали ни при одном из методов.
4.8.2. Создание картофеля, устойчивого к вредителям и болезням
4.8.2.1. Вирусы
Наиболее успешная страница в биотехнологиии растений - это создание генноинженерных растений, устойчивых к вирусам. До сих пор продолжают обнаруживать новые источники генов антивирусной устойчивости.
Один из лучших примеров - это создание резистентности за счет использования белков оболочки вирусов. Эта стратегия сейчас широко используется против таких вирусов как: Х-, У-, вирус скручивания листьев картофеля. Были проведены широкомасштабные испытания трансгенного картофеля, устойчивого к вирусам за счет экспрессии белков оболочки. Эти исследования подтверждают, что защитный эффект с течением времени сохраняется [Davies, 1996]. В России получены трансгенные растения картофеля сортов Зарево, Львовянка, экспрессирующие ген белка оболочки Х-вируса, и сорта Белорусский-3, экспрессирующие ген белка оболочки