Влияние гена rolC агробактерий на процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточной культуре Panax ginseng C.A. Mey

• Автор: Горпенченко, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Глава 1. Обзор литературы
1.1. Размножение растений in vivo и in vitro', биотехнологические аспекты
1.1.1. Размножений растений in vivo: формирование зиготических и соматических зародышей
1.1.2. Размножение растений in vitro: гистогенез, органогенез, соматический эмбриогенез
1.1.3. Особенности размножения женьшеня in vivo и in vitro
1.2. Инициация и механизмы регуляция морфогенеза in vitro
1.2.1. Влияние внешних факторов и условий культивирования на морфогенез
1.2.2. Гормональная регуляция морфогенеза
1.2.3. Генетический контроль морфогенеза
1.3. Агробактериальная трансформация и функции гена rolC в трансформированных клеточных культурах
Глава 2. Материал и методы
2.1. Материал
2.2. Методы
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Особенности системы размножения и формирования зародыша женьшеня
3.2. Морфология и гистология трансгенных линий женьшеня в зависимости от
уровня экспрессии гена rolC
3.3. Органогенез и соматический эмбриогенез в трансформированной геном
rolC клеточной линии женьшеня 2сЗ
Заключение
Выводы
Литература

Женьшень настоящий Рапах ginseng С.А. Меу. является одним из наиболее ценных и известных лекарственных растений. Мировой объем производства и продажи препаратов женьшеня постоянно увеличивается, а проблема источника сырья становится все более актуальной. В основе биотехнологического получения различных растений, в том числе и женьшеня, лежат процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Широко распространенные приемы, такие как использование экзогенных фитогормонов и индукция морфогенеза абиотическими факторами, далеко не всегда приводят к получению морфогенных структур или эмбриоидов, поскольку дифференциация клеток в культуре in vitro зависит не только от внешних стимулов, но во многом определяется генотипом и текущим состоянием клеток экспланта (Бутенко, 1964; Лутова, 1994; Wang, Bhalla, 2004). Поэтому многочисленные исследования направлены на изучение состояния тотипотентности клетки, в котором она может выбирать направление дальнейшей дифференциации. Каскады реакций, запускающие работу генов, контролирующих различные этапы морфогенеза как в интактном растении, так и в культуре ткани не всегда известны, а процесс развития клеток, тканей и органов трудно изменить (Mordhorst et al., 2002; Groß-Hardt, Laux, 2003). В связи с этим управление морфогенезом с помощью регуляции активности генов приобретает особое значение. Важное место в этих исследованиях занимает регуляция морфогенеза с помощью чужеродных генов, введенных в ДНК растений с помощью векторов.
Агробактерии широко используются для генетической трансформации растений. Гены roi содержатся в части плазмидной ДНК агробактерий (Т-ДНК) Agrobacterium rhizogenes (Spena et al., 1987). При взаимодействии агробактерии с растительной клеткой гены в составе Т-ДНК интегрируются в хромосомы. Трансформация генами семейства roi приводит к неорганизованному росту клеток с изменением программы развития, при этом сохраняется способность клеток к дифференцировке. Отдельные гены семейства roi могут индуцировать образование апикальных меристем побегов. Вероятно, гены roi обладают общим регуляторным действием, которое представляет интерес для биотехнологии. Один из этих генов - ген rolC - индуцировал в клеточном штамме женьшеня образование структур, морфология которых напоминала побеги, эмбриоиды и корни. Это говорит о том, что экспрессии одного встроенного гена оказалось достаточно для придания клеткам трансформированного каллуса состояния тотипотентности и возможности реализовать все имеющиеся пути развития, что делает ген rolC весьма перспективным при изучении регуляции морфогенеза.
Цель настоящего исследования - изучение процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточных линиях женьшеня, интактных и трансформированных геном rolC, и создания на этой основе модельной системы для исследования регуляции морфогенеза.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить особенности формирования и развития зародышей женьшеня в семени интактных растений, описать их морфологию и гистологию до дессиминации.
2) Изучить морфологию и гистологию клеточных линий женьшеня, трансформированных геном rolC.
3) Описать последовательность этапов органогенеза и соматического эмбриогенеза в трансформированной клеточной линии 2сЗ.
4) Провести молекулярный анализ трансгенных линий и оценить влияние экспрессии гена rolC на процессы дифференциации клеток женьшеня.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспрессия гена rolC в трансгенных клеточных линиях женьшеня приводит к изменению программы развития клеток и вызывает разные типы дифференцировки клеток (гистогенез, ризогенез, геммогенез, соматический эмбриогенез).
2. Отдельный ген не растительного происхождения (ген rolQ способен индуцировать соматический эмбриогенез у растений женьшеня; этот процесс не является результатом мутации гена rolC, или следствием инсерционного Т-ДНК мутагенеза.
3. Начальные этапы развития соматического зародыша (эмбриоида) in vitro и полового зародыша in vivo у женьшеня протекают сходно.
4. В трансгенной линии 2сЗ развитие эмбриоидов осложняется процессом вторичного соматического эмбриогенеза и аномалиями развития, свидетельствующими о постоянном присутствии фактора, инициирующего образование дополнительных апикальных меристем и эмбриоидов.
Основная часть работы выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвениого института ДВО РАН под руководством академика Ю.Н. Журавлева, в рамках плановой тематики лаборатории. Исследования с помощью метода сканирующей электронной микроскопии проводили в лаборатории эмбриологии растений Ботанического института им. Комарова РАН г. Санкт-Петербург. Работа была частично поддержана грантами государственного научно-технического проекта "Биологическое разнообразие", РФФИ (03-04-48102) и средствами фонда US CRDF и Министерства Образования РФ (проект VL-003).
Основные результаты получены автором, молекулярно-генетические исследования проводились совместно с к.б.н. К.В. Киселевым (группа биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН).
Автор выражает искреннюю признательность академику РАН Ю.Н. Журавлеву и к.б.н. О.Г. Корень за руководство при выполнении работы; чл.-корр. РАН Т.Б. Батыгиной (БИН им. Комарова, СПб) за теплый прием в лаборатории эмбриологии растений, всестороннюю помощь и консультации в работе; чл.-корр., д.б.н. В.П. Булгакову (БПИ ДВО РАН) за рекомендации по подготовке рукописи работы и предоставление изучаемых клеточных линий; к.б.н. К.В. Киселеву (БПИ ДВО РАН) за помощь в проведении молекулярно-

Реакция обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)
Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе, запрограммированном на 37 °С в течение 60-70 минут, 70 °С в течение 10 минут и охлаждением до 4 С. Использовался набор фирмы Силекс М (Москва, Россия). Реакцию проводили в объеме 50мкл 1х RT-буфера, содержащего 0,2 мМ каждого dNTP, 200 единиц активности M-MLV-полимеразы, 0,2 рМ олиго-(дТ)|5 праймеров и 2-5 мкг тотальной РНК из культур 2сЗ, G и GV обработанных ДНКазой. После наработки кДНК проводили ПЦР по методике, описанной выше.
Продукты амплификации анализировали в 1,5 % агарозном геле в однократном ТВЕ буфере. В качестве маркера молекулярных весов наносился синтетический маркер с шагом в 100 пар оснований (100-1000 пар, Сибэнзим, Россия).
Thermal asymmetric interlaced (TAIL ПЦР)
Метод TAIL ПЦР (Thermal asymmetric interlaced) был использован в соответствии со стандартной методикой (Liu et ab, 1995). Геномную ДНК из клеточного штамма G и линии 2сЗ амплифицировали с использованием праймера TAIL1 5-GCT GAT AGT GAC СТТ AGG CGA СТ-3' (гомологичен участку из нопалинсинтазного промотора около правой границы Т-ДНК) и обратным 10 п.н. случайным праймером Random-C8 5'-TGGACCGGTG-3'. Праймер Random-C8 был рекомендован Козыренко М.М. -сотрудником лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН, т.к. именно этот праймер давал наибольшее количество ампликонов при использовании его в RAPD ПЦР на ДНК женьшеня. После реакции ПЦР было определено семь ампликонов для ДНК из штамма G и восемь для 2сЗ ДНК. Последовательность из 497 п.н., которая отсутствовала в G продуктах ПЦР, была очищена и реамплифицирована со вторым праймером TAIL2 5'-TGC GGT ТСТ GTC AGT ТСС ААА-3' и Random праймером. Для избежания возможности заражения или получения сигнала с Random праймерами проводили рестрикцию двумя специфическими эднонуклеазами: Hinf I и Sph I.
ПЦР И ОТ-ПЦР продукты были секвенированы с помощью Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer Biosystems, Forster City, CA), следуя рекомендациям производителя.
Статистический анализ
Результаты тестов были обработаны при помощи программы Statistica, версия 5.5. Все данные представлены как среднее значение со стандартной ошибкой. Уровень значимости 0,05 был выбран как минимальное значение статистической разницы между величинами во всех экспериментах.