Взаимодействие ржавчинных грибов с клеточными культурами растений

• Автор: Смирнова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.24, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 с. : ил

В В Е Д Е Н И Е
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности биологии ржавчинных грибов
1.2. Особенности биологии культивируемых клеток растений
1.3. Использование метода культуры тканей растений
в фитопатологических исследованиях
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования
Методы исследования
Глава III. Особенности получения и морфо-физиологические
характеристики клеточных культур

Глава IV. Прорастание урединиоспор Р. ^гатМя 1гШа при
разных способах инокуляции и степени раздробленности
каллусных культур пшеницы
Глава V. Особенности прорастания урединиоспор Р. %гатт$ 1гШа и
и. сагуоркуШпш на разных поверхностях
и культурах клеток
Глава VI. Прорастание урединиоспор Р. угатт^ 1гШа и и. сагуоркуШпш на каллусных культурах растений-хозяев в зависимости от их
морфо-физиологическбго состояния
Глава VII. Сравнение прорастания спор и развития Р. угаттк ггШс1 на каллусных и суспензионных культурах пшеницы
и люцерны
Глава VIII, Развитие Р. угагттз 1гШс при культивировании на
каллусных культурах в течении нескольких суток
Глава IX. Прорастание и развитие Р. угатти 1гНШ на каллусах пшеницы различных генотипов, отличающихся по устойчивости к стеблевой ржавчине

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ

Актуальность темы
Защита растений от болезней является одной из важнейших задач, стоящих перед человечеством. Около 83% болезней растений вызываются грибами, и только остальные - бактериями и вирусами [Мюллер, 1995]. Ущерб, наносимый патогенными грибами культурным растениям, ежегодно исчисляется во всем мире миллиардами долларов. Наиболее экономически выгодными и экологически чистыми средствами защиты от фитопатогенов является селекция растений на устойчивость, широко ведущаяся в настоящий момент как традиционными, так и современными методами, связанными с применением биотехнологии. Перспективность использования методов культуры тканей, клеточной и генной инженерии для получения устойчивых генотипов растений доказана в ряде работ [Аврова и др., 1993; Левенко, 1998; Hammerschlag et al., 1994; Cao et al., 1998; Dempsey et al., 1998]. Одним из важнейших направлений биотехнологии является двойная культура грибного патогена с клетками растения - хозяина, которая может быть использована как в прикладных, так и фундаментальных исследованиях. В последнее время, при все большем внедрении клеточных технологий в растениеводство и широком развитии методов клеточной и генной инженерии, такой подход является вполне актуальным, в условиях, когда усилия по созданию новых форм растений переносятся с уровня манипуляции с целым организмом на уровень клеток. При этом должны измениться и методы отбора и селекции и стать адаптированными к возможности скрининга еще на клеточном уровне. На важность применения этого метода указывают многие ученые [Helgeson, 1983; Ingram, 1983; Daub, 1986]. Исследования с использованием метода двойной культуры ведутся в ряде научных центров, в том числе и в нашей стране [Аврова, 1993; Кута и др., 1999; Evenor et al., 1994; Able et al., 1998 ].
В работе исследовано взаимодействие облигатных патогенов двух видов ржавчинных грибов - Puccinia graminis Pers. f.sp. tritici и Uromyces

При проведении всех этапов процедуры было важным как можно меньше воздействовать на кусочки, чтобы предотвратить возможного смыва урединиоспор или повреждения картины взаимодействия на поверхности клеток. При фиксации суспензионных культур все растворы аккуратно наносились тонкой Пастеровской пипеткой непосредственно на поверхность чашки Петри с культурой, таким образом, чтобы не смыть поверхностный слой клеток со спорами. После завершения процедуры фиксации скальпелем вырезался участок культуры вместе со средой размером около 5мм2 и помещался в спирт для хранения или переноса для дальнейших этапов подготовки для СЭМ.
5. Определение процента живых и мертвых клеток раствором эозина.
Для определения жизнеспособности каллусной культуры кроме визуальных, структурных и ростовых признаков использовался метод определения процента живых и мертвых клеток при окрашивании витальным красителем эозином. Каллусная культура перед окрашиванием мацерировалась в 2% растворе пектиназы в течении 2-3 часов на шейкере. Таким образом получалась суспензия одиночных клеток и небольших клеточных агрегатов. Окрашивание проводилось 0.1% водным раствором эозина. Считается, что окрашиванию подвергаются мертвые или деградирующие клетки, в то время как живые остаются не окрашенными. В то же время в литературе имеются свидетельства того, что не всегда окрашивание таким способом отражает точно действительную картину жизнеспособности в клеточной популяции [Гусев и др., 1981; Юрина, 1985; Smith et. al., 1982]. Так же указывается, что не всегда можно достаточно точно определить какая из клеток является окрашенной, а какая - нет [Юрина, 1985]. Учитывая все вышесказанное, данный метод использовался как вспомогательный при определении жизнеспособности культур.
6. Проведение подсчетов и статистическая обработка полученных результатов. Для проведения подсчетов прорастаемости спор на разных типах культур обсчитывалось около 2-3 тысяч урединиоспор на каждом