Фрагменты рибосомных генов человека в составе внеклеточной ДНК: факторы стресс-сигнализации

• Автор: Костюк, Светлана Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : 28 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Свойства внеклеточной ДНК
1.1. Концентрация внДНК
1.2. Размеры фрагментов внДНК
1.3. Изменение содержания различных последовательностей в внДНК
1.4. Модификация оснований внДНК
2. Происхождение фрагментов внДНК в организме
3. Взаимодействие фрагментов внДНК с клетками
4. Рецепторы, опознающие фрагменты внДНК
4.1. Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR)
4.1.1. Общая характеристика белков TLR
4.1.2. Рецепторы TLR9
4.1.2.1. Природные и синтетические лиганды для белков TLR9
4.1.2.2. Ингибиторы взаимодействия CpG-ДНК с TLR9
4.1.2.3. Пути передачи сигнала через TLR9
4.1.2.4. Полиморфные варианты гена TLR9
4.2. TLR-независимый путь узнавания нуклеиновых кислот
5. Выводы из обзора литературы и постановка задачи исследования
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Анализируемая выборка
2. Определение свойств внДНК
2.1. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы периферической крови
2.2. Определение концентрации внДНК
2.3. Определение размеров фрагментов ДНК
2.4. Определение концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови
2.5. Определение частоты TCR - мутантных лимфоцитов
3. Определение действия внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека
3.1. Выделение лимфоцитов
3.2. Приготовление образцов ДНК
3.3. Приготовление клеточных препаратов
3.4. Цитохимические методы
3.4.1. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)
3.4.2. Анализ конформации ядрышка
3.5. Биохимические методы
3.5.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов
3.5.2. Определение концентрации РНК
3.5.3. Определение ферментативной активности каспазы
3.5.4. Определение нуклеазной активности
3.6. Иммунологические методы
3.6.1. Определение концентрации ИЛ
3.6.2. Определение концентрации ФНО-а
3.7. Ингибирование TLR9 клеточного пути
3.8. Оценка экспрессии TLR9 методом real-time ШДР
4. Анализ сыворотки (плазмы) человека на наличие специфичных антител к фрагментам ТОрДНК
4.1. Приготовление образцов двуспиральной ДНК для нанесения на фильтр
4.2. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах
4.3. Обработка сыворотки ДНКазой
5. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Свойства внДНК плазмы крови облученных лиц
1.1. Концентрация внДНК

1.2. Длины фрагментов внДНК
1.3. Концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови
1.4. Содержание повторяющихся последовательностей генома во внДНКплазмы крови
1.5. Частота встречаемости ТСЯ-мутантных лимфоцитов
1.6. Анализ связи между определяемыми параметрами методом главных компонент
2. Действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека
2.1. Экспериментальные подходы к исследованию активации лимфоцитов человека при действии фрагментов внДНК
2.2. Определение изменения пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района 1ц12 при действии фрагментов внДНК
2.3. Изменения конформации ядрышка при действии фрагментов внДНК на лимфоциты человека
2.4. Изменение некоторых биохимических показателей культивируемых лимфоцитов при действии фрагментов ТОрДНК
2.4.1. Общее количество РНК в лимфоцитах
2.4.2. Активность каспазы
2.4.3. Анализ изменения нуклеазной активности
2.5. Влияние ТОрДНК на синтез лимфоцитами цитокинов
2.5.1. Изменение концентрации ИЛ
2.5.2. Изменение концентрации ФНО-а
2.6. Определение возможных известных клеточных сигнальных путей, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека
2.6.1. Ингибирование Т1Л9 клеточного пути хлорокином
2.6.2. Ингибирование супрессорным нуклеотидом проведения сигнала через ТЫ19 при стимуляции лимфоцитов фрагментами
продукцией N0 и свободных форм кислорода, синтезом низкомолекулярных медиаторов воспаления и группы провоспалительных цитокинов, к которым относятся интерлейкины: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-18, фактор некроза опухоли, интерфероны I типа, хемокины [Kawai et al., 2006; Akira et al., 2004; Majewska et al., 2006]. Также происходит активация цитокинов, стимулирующих дифференцировку Thl лимфоцитов- ИЛ-12, ИЛ-23, ИЛ-27 [Kawai et al., 2006; Akira et al., 2004], что является своеобразным мостиком к началу развития реакций специфического иммунитета, связанных с распознаванием антигенных структур микроорганизмов.
4.1.2.4. Полиморфные варианты гена TLR9.
Поскольку TLR9 - рецептор, в первую очередь распознающий фрагменты бактериальной ДНК, логично предположить, что функциональные полиморфизмы TLR9 могут быть ассоциированы с рядом инфекционных заболеваний [Schroder et al., 2005].
В таблице 1 суммированы основные данные о связи полиморфных вариантов гена TLR9 с рядом заболеваний. При исследовании ОНП в генах, вовлеченных в узнавание бактериальной инфекции и предрасположенности к резервуарному илеиту (pouchitis), были оценены ассоциации ОНП в генах TLR4 +896А>Г, TLR9-123 7Т>С, TLR9+2848G>A, CD14-260T и IRAKM + 22148G>A. Различие в частоте носительства аллеля TLR9-1237C было найдено только между группами с редким pouchitis и хроническим вторичным pouchitis [Р = 0.028, (OR) = 3.2, 95% CI = 1.2-8.6] [Nakashima et al., 2006]. Комбинированный анализ носительства аллелей TLR9-1237C и C.D14-260Т показал усиление различий групп с хроническим вторичным pouchitis и редким pouchitis. Кроме того, среди пациентов с язвенным колитом, провоцирующим хронический вторичный резервуарный илеит после хирургического вмешательства, повышено число носителей аллелей CD 14-260Т и TLR9-1237C [Nakashima et al., 2006].
При исследовании путей проведения сигнала после стимуляции TLR2 и TLR4 малярийным плазмодием, было показано, что TLR9 также вовлекается