Исследование экспрессии генов нейротрофических факторов человека в трансгенных линиях дрозофил

• Автор: Ефанов, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1.Трансгенные животные как экспериментальная модель 7 изучения генной экспрессии.
1.1.1. Использование трансгенеза в решении проблем генетики развития.
1.1.2. Трансгенные Drosophila.
1.1.3. Гены Notch и Delta.
1.2. Векторы для клонирования в клетках насекомых.
1.2.1. Использование бакуловирусов для экспрессии чужеродных генов в 13 клетках насекомых.
1.2.1.1. Посттрансляционная модификация в клетках насекомых
1.2.2.Использование P-элементов для экспресии чужеродных генов 14 в клетках насекомых.
1.2.2.1 .Общая характеристика P-элементов Drosophila.
1.2.2.2.Векторы Карнеги.
1.2.2.3. Вектор Карнеги 20.
1.2.2.4. Вектор CaSpeR.
1.2.2.5. Вектор рРА-1 с геном Adh.
1.2.2.6. Вектор pUChsneo.
1.2.2.7. Плазмиды-помощники.
1.3. Нейротрофические факторы.
1.3.1. Общая характеристика нейротрофических факторов.
1.3.2. Нейротрофические факторы суперсемейства TGF-ß.
1.3.2.1. Характеристика нейротрофических факторов суперсемейства TGF-ß.
1.3.2.2. Рецепторы нейротрофических факторов суперсемейства TGF-ß.
1.3.2.3. Биологические эффекты нуль-мутаций лигандов и рецепторов семейства 25 GDNF.
1.3.2.4. Сигнальный каскад Ret.
1.3.2.5. Эффект GDNF в культурах клеток и тканей.
1.3.2.6.3ащитные и восстановительные свойства GDNF.
І.З.З.Фактор роста нервов.
1.3.3.1.Характеристика фактора роста нервов.

1.З.З.2. Сигнальные каскады, вызываемые NGF
1.3.3.2.1.Характеристика сигнальных каскадов, вызываемых МОР.
1.3.3.2.2. Каэ-МАРК киназный путь.
1.3.3.2.2.1. Генная экспрессия: немедленно ранние гены.
1.3.3.2.2.2.Экспрессия задержанно-ранних генов.
1.3.3.2.2.3.Фосфолипазный путь.
1.3.3.2.3. Ыа$-независимые сигнальные пути.
1.3.3.2.4. Нейротрофиновый р75 рецептор.
1.3.4.Нейротрофический фактор мозга (BDNF).
1.3.4.1.0бщая характеристика нейротрофического фактора мозга.
1.3.4.2.Исследование мышей, нокаутированных по гену ЕШХР.
1.3.4.3. Внутриклеточные каскады, активируемые ВВ1Т.
1.3.5. Перспективы использования нейротрофических факторов в 46 лечении болезни Паркинсона.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1.Ферменты и реактивы.
2.2. Конструкции.
2.3.Приготовление компетентных клеток.
2.4.Трансформация Е. соИ.
2.5. Выделение плазмидной ДНК из Е. сой.
2.6. Метод инъекций.
2.7. Выведение линий.
2.8. Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну).
2.8.1. Выделение хромосомной ДНК.
2.8.2. Рестрикция хромосомной ДНК.
2.8.3. Г ель-электрофорез ДНК.
2.8.4. Перенос ДНК на фильтр.
2.8.5. Приготовление меченого зонда.
2.8.6. Гибридизация.
2.9. Контроль экспрессии (Нозерн блот-гибридизация).
2.9.1. Выделение тотальной РНК.
2.9.2. Гель - электрофорез РНК.
2.9.3. Перенос.

2.9.4.Гибридизация.
2.10. Гибридизация in situ на целых эмбрионах.
2.10.1. Приготовление меченого зонда.
2.10.2. Сбор и фиксация эмбрионов.
2.10.3. Подготовка эмбрионов к гибридизации.
2.10.4. Гибридизация.
2.10.5. Предадсорбция антител.
2.10.6. Отмывка гибридизации и обработка антителами.
2.10.7. Окрашивание.
2.11. Гибридизация in situ на срезах.
2.12. Вестернблоттинг.
2.12.1. Получение белковых лизатов.
2.12.2. Фракционирование белков в полиакриламидном геле.
2.12.3. Имунноблоттинг.
2.12.4. Имуннодетекция.
2.13. Иммуногистохимическое окрашивание на тирозингидроксилазу 70 и глиальный фибрилярный кислый белок.
2.14. Окрашивание X-gal.
Глава 3. Результаты.
Г лава 4. Обсуждение результатов.
Выводы.
Список литературы.

Было показано, что разовая доза СВ№, необходимая для обеспечения видимого восстановительного эффекта у грызунов составляет 100 мкг. Через 4 недели после инъекции 6-ОНВА (6-гидроксидофамин) в медиальный пучок переднего мозга вводили различные дозы ОВ№ (0.1-100 мкг) справа, впереди или сверху от черной субстанции. Через 5 недель уровень дофамина в черной субстанции составлял 80% у животных, получивших 100 мкг СНЖР, в отличие от остальных опытов и контроля, где уровень дофамина составил 20% от нормы. Поведенческие тесты также показали, что видимый эффект достигается при введении не менее 100 мкг ОВ№ (НоПег ы а1., 1994).
Интересный эксперимент по защите с помощью ОВОТ трансплантированной фетальной нервной ткани в мозге реципиента от токсического воздействия 6-ОНВА описан в работе Юрека. Инъекция 6-ОНВА в компактную часть черной субстанции и в медиальный пучок переднего мозга у крыс приводит к полному разрушению пути, идущего от черной субстанции к стриатуму. Через 4 недели после введения 6-ОНБА в разрушенный стриатум пересаживали фетальную ткань вентральной части среднего мозга эмбрионов стадии Е 13 -Е 15. Через пять недель после трансплантации в стриатум вводили СЮЫБ, и через 6 часов после этого - 6-ОНВА. Поведенческие тесты и гистохимические исследования показали, что СЮ№ частично защищает трансплантат от токсичности 6-ОНВА. Количество ТН+ нейонов в 9 раз выше, а количественные результаты поведенческих тестов - почти в два раза ниже, чем у контрольных животных, не получавших СВЫБ (Уигек Ф а1., 1999).
Эти данные свидетельствуют о важной роли СОМЕ во взрослом организме -защите и восстановлении дифференцированных нервных клеток после повреждений. Вероятно, ОБОТ влияет на механизм клеточной гибели, включающийся при различных повреждениях, что объяснило бы такой широкий спектр действия этого фактора при разных процессах, приводящих к разрушению клетки.
1.3.3.Фактор роста нервов.
1.3.3.1.Характеристика фактора роста нервов.
Фактор роста нервов (N0?) представляет собой гликопротеин, состоящий из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 13000 дальтон (Гилберт, 1995). N0? поддерживает жизнеспособность симпатических и сенсорных нейронов в процессе развития, а экзогенно введенный МСБ влияет на направление роста нейронов (Гилберт, 1995). В 1989 году Эдвардс и др. (Гилберт, 1995) представили убедительные данные, свидетельствующие о том, что синтез клетками КОБ приводит к иннервации этих клеток. Они сконструировали плазмиду, содержащую мышиный ген п^, присоединенный к регуляторным элементам гена инсулина крысы. Иначе говоря, они поместили ген п^ под