Изучение конъюгативной способности крупных плазмид из почвенных штаммов Bacillus subtilis

• Автор: Федорина, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Список сокращений
• ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл
1.1.1. Общая характеристика бациллярных плазмид
1.1.2. Свойства, определяемые генами мелких плазмид бацилл
1.1.3. Свойства, определяемые генами крупных плазмид бацилл
1.1.4. Репликация плазмид
1.1.4.1 Репликация по механизму катящегося кольца
1.1.4.2. Тета-тип репликации
ф 1.2. Бактериальная конъюгация
1.2.1. Механизмы конъюгационных процессов у грамотрицательных
микроорганизмов на примере F-фактора E.coli
1.2.2. Конъюгация у грамположительных микроорганизмов
1.2.2.1. Механизмы конъюгации у грамположительных бактерий
1.2.2.1.1. Структуры, вовлекаемые в процесс конъюгации
1.2.2.1.2. Сходство элементов конъюгатнвного аппарата с компонентами
системы секреции IV типа
ф 1.2.2.2. Конъюгативная мобилизация RCR плазмид
1.2.2.3. Конъюгативные транспозоны
1.2.2.4. Конъюгация у бацилл
1.2.2.4.1. Группа B.cereus
1.2.2.4.2. Группа В. subtilis
1.2.2.5. Конъюгация у других грамположительных микроорганизмов
1.2.2.5.1. Конъюгативный перенос с участием плазмид широкого круга
хозяев. Конъюгация у стафилококков, лактококков и других грамположительных микроорганизмов
1.2.2.5.2. Феромонзависимая конъюгация у энтерококков
0 1.2.2.5.З. Конъюгация у стрептомицетов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Поиск и характеристика крупных природных плазмид в штаммах
Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области
3.1.1. Поиск крупных плазмид в штаммах B.subtilis
^ 3.1.2. Сравнение обнаруженных крупных плазмид с минирепликоиом
плазмиды р19 из белорусской коллекции B.subtilis
3.1.3. Определение способности крупной плазмиды из штамма B.subtilis
1440 к мобилизационному переносу
3.2. Изучение конъюгативных способностей крупной плазмиды из
почвенного штамма B.subtilis
3.2.1. Мобилизация мелких неконъюгативных плазмид
3.2.1.1. Изучение особенностей мобилизации pUBllO
3.2.1.1.1. Определяющая роль р19 в мобилизации pUBllO
3.2.1.1.2. Изучение влияния протеиназы К на мобилизацию pUBllO
3.2.1.1.3. Кинетика переноса pUBllO при разных температурах
3.2.1.1.4. Мобилизационный перенос pUBllO при использовании
различных штаммов B.subtilis
3.2.1.1.5. Перенос pUBllO в штаммы разных видов Bacillus
3.2.1.2. Мобилизация других неконъюгативных плазмид
3.2.1.2.1. Изучение переноса плазмид с сигма-типом репликации (рВС16,
рС194)
3.2.1.2.2. Изучение переноса плазмиды, имеющей тета-репликон
® 3.2.2. Изучение конъюгативного переноса собственно крупной
плазмиды р19
3.2.2.1. Маркирование крупной криптической плазмиды р19
3.2.2.2. Частота конъюгативного переноса плазмиды pl9cat
3.2.2.3. Коныогативный перенос pl9cat при разных соотношениях донора
и реципиента
3.2.2.4. Кинетика конъюгативного переноса pl9cat
3.2.2.5. Особенности переноса р19 при использовании в качестве
партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis
3.2.3. Анализ мутантов р19 с нарушенной способностью к конъюгации

3.2.3.1. Клонирование в клетках ЕхоИ фрагментов р19, обуславливающих способность плазмиды к коныогационному переносу
3.2.3.2, Идентификация фрагмента ДНК, соответствующего рЗ-102, в клонотеке фрагментов ДНК р19
ф З.2.З.З. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК
р 19 и се анализ
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение
обходимый для ее мобилизации, не является областью релаксации ДНК. Кроме того, были получены экспериментальные данные, подтверждающие возможность такого переноса (Possoz et al., 2001). Эксперименты основывались на разной чувствительности одно- и двунитевой ДНК к действию рестриктазы Sal I. Поскольку однонитевая ДНК не является субстратом для Sal I (эндонуклеазы II типа), присутствие фермента могло повлиять на конъюгацию лишь в случае переноса двунитевой молекулы. В качестве реципиентов использовались штаммы S.lividans, различающиеся наличием или отсутствием системы рестрикции-модификации Sal I (RM). Влияние действия рестриктазы на перенос плазмидной ДНК изучалось с использованием pTS142 - бифункциональной производной плазмиды Streptomyces pSAM2. pTS142 содержит область oriT плазмиды RK2 E.coli и может быть мобилизована из штамма-донора E.coli в клетки S.lividans в однонитевой форме. При использовании в качестве донора E.coli мобилизация pTS142 происходила с одинаковой частотой независимо от того, имел ли реципиентный штамм S.lividans RM-систему Sal I. Однако когда партнерами в конъюгации были штаммы S.lividans, плазмида pTS142, имеющая 17 сайтов узнавания Sal I, с высокой эффективностью передавалась только в клетки штамма, не имеющего Sal I RM. В том случае, когда использовался реципиент S.lividans с экспрессирующейся RM-системой Sal I, частота конъюгации падала с 1 до 104 (Possoz et al., 2001).
Сходство белков Тга с белками FtsK E.coli и Spo IIIE B.subtilis, которые участвуют в переносе двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в процессе клеточного деления и в процессе споруляции соответственно, позволяет предположить участие Тга именно в переносе плазмид в мицелий реципиента. Согласно предполагаемой модели, мономеры Тга образуют в мембране кольцеподобную структуру вокруг двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК плазмиды. Подобно FtsK или Spo IIIE, Тга может проталкивать ДНК в мицелий реципиента, используя энергию гидролиза АТФ.
Определяющие внутримицелиальный перенос белки Spd предположительно формируют совместно с Тга пороподобные структуры в мицелиальных перегородках, способствуя быстрому распространению плазмиды внутри мицелия реципиента. Сверхэкспрессия Тга часто токсична, регулируется она транскрипционным репрессо-ром TraR, кодируемым плазмидой. В областях мицелия реципиента, недавно получивших плазмиду функциональный TraR отсутствует и транскрипция tra индуцирована. Временная сверхэкспрессия Тга может приводить к ингибированию роста и за-