Изучение Quorum Sensing систем регуляции у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia

• Автор: Веселова, Марина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил.

Список сокращений:
QS — Quorum Sensing — чувство кворума (дословно)
АГЛ — ацил-гомоссринлактон АИ — аутоиндуктор
ГенБанк—База данных GenBank NCBI
NCBI —-National Center for Biotechnology Information
ORF — открытая рамка считывания
ДИК — дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК — рибонуклеиновая кислота
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ТСХ — тонкослойная хроматография
п.н., т.п.н. — пар нуклеотидов, тысяч пар нуклеотидов
ПГ — полигалактуроназа
ПМЭ —- пектинметилэстераза
ФКК — феназин-1 -карбоновая кислота
2-ОН-ФКК— 2-гидрокси-феназин-1-карбоновая кислота
2-OH-PHZ — 2-гидроксифеназин
PCN — феназин-1-карбоксамид
ИПТГ — изопропил-бетаЛЭ-тиогалактозид
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
X-Gal — 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-(3-в-галактозид
Ар -— ампициллин
Cm — хлорамфеникол
Gm — гентамицин
Km — канамицин
Tet — тетрациклин
HPLC — high-performance liquid chromatography С4-АГЛ — К-бутаноил-Т-гомосеринлактон Сб-АГЛ —- К-гексаноил-Ь-гомосеринлактон Сй-АГЛ •— М-октаноил-Ь-гомосоринлактон Сю-АГЛ — N-деканоил -L-гомосеринлактон ЗОСб-АГ'Л — Ы-(3-оксо-гексаноил)-Ь-гомосеринлактон ЗОСз-АГЛ — Ы-(3-оксо-октаноил-Ь-гомосеринлактон ЗОС12-АГЛ — М-(3-оксо-додеканоил)-Ь- гомосеринлактон ЗОНС4-АГЛ — Н-(3-гидрокси- бутаноил)-Ь-гомосеринлактон ЗОНСб-АГЛ —К-(3-гидрокси-гексаноил)-Ь-гомосеринлактон ЗОНС'з-АГЛ — №(3-гидрокси-октаноил)-Ь-гомосеринлактон ЗОНСю-АГЛ — К-(3-гидрокси-деканоил)-Ь-гомосеринлактон
I. ВВЕДЕНИЕ
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. QS СИСТЕМЫ LUXI-LUXR ТИПА 1ТАМОТРИЦАТШ1ЫТЫХ БАКТЕРИЙ
I. IФункционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio fischeri
1.2 АГЛ и функионирование Luxl— подобных белков
1.3 Чэункционирование LuxR-подобных белков
2. QS СИСТЕМЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЪНЫХ БАКТЕРИЙ С УЧАСТИЕМ АИ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ
3. QS СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ АИ-2
4. ОБОБЩЕНИЕ ДАННЫХ О НАИБОЛЕЕ ИЗУЧЕННЫХ СИНТАЗАХ АУТОИНДУКТОРОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В СИНТЕЗЕ АГЛ И АИ-2
5. QS СИСТЕМЫ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS
J. 1. QS система Pi aeruginosa
5.1.1 LasI-LasR и Rhll-RhlR системы регуляции
5.1.2 Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами
5.2 QS системы других видов Pseudomonas
5.2.1 Pseudomonas aureofaciens /Pseudomonas chlororaphis
5.2.2. Pseudomonas Jluorescens
5.2.3 Pseudomonas putida
5.2.4 Pseudomonas syringae
6. QS СИСТЕМА БАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА ВORKHOLDER1A CEPACIA
HI. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды и условия культивирования
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды
3. Определение продукции АГЛ
4. Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуральных экстрактах
5. Методы работы с ДНК
6. Транспозонный мутагенез и определение локализации инсерцииминитранспозона
7. Пласпозоиный мутагенез и определение места инсерции пласпозона
8. Идентификация генов с помощью ПЦР
9. Клонирование генов
10. Получение инсерционных мутантов P. chlororaphis 449 методом замены генов
11. Определение экспрессии гена vfr в клеточных лизатах
12. Анализ ферментативных активностей
13. Определение способности клеток бактерий к миграции по поверхности среды (сворминг)
14. Определение антагонистической активности
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ
А. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING РЕГУЛЯЦИИ У PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS
1. Скрининг штаммов, синтезирующих АГЛ, из коллекции почвенных бактерий
2. Характеристика группы бактерий Pi chlororaphis, синтезирующих'АГЛ
2.1 Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигапактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis
2.2 Исследование влияния температуры на синтез АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеазную активность у штаммов P. chlororaphis
2.3 Идентификация с помощью ПЦР генов двух QS систем и гена phzOy штаммов P. chlororaphis
3. Quorum Sensing системы P. chlorokiphis449 и изучение их роли в регуляции клеточных
ПРОЦЕССОВ
3.1 Клонирование и секвенирование геновphzl, csal из P. chlororaphis
3.1.1 Клонирование гена phcl из P. chlororaphis
3.1.2 Клонирование гена csal нз P. chlororaphis
3.2 Получение jмутации в гене csal у P. chlororaphis
3.3 Исследование влияния мутации в гене csal на свойства P. chlororaphis
3.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis с мутацией в гене csal
3.3.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal
3.3.3 Лнпазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal
3.3.4 Полигалактуроназная и пекгинметилэстеразная активность в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal
3.3.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal
3.3.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal
3.3.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 и штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal к миграции по поверхности среды (сворминг)
3.4 Влияние плазмиды рМЕ6863, содержащей клонированный ген N-ацил-гомосерин пактоназы, на синтез АГЛ ирегу'лягщю клеточных процессов P. chlororaphis
4. Исследование взаимодействия двухкомпонентной системы GacA-GacS с QS системой и ее роли
В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ у P. CHLOROR. WHK
4.1 Получение транспозонных мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированным геном gacS
4.2 Клонирование и секвенировапие части гена gacS из P. chlororaphis
4.3 Исследование влияния мутации в гене gacS на свойства P. chlororaphis
4.3.1 Продукция АГЛ в штамме Л. chlororaphis 449 с мутацией в гепс gacS
4.4.2 Активность экзонротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS
4.4.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS
4.4.4 Полигалактуроназная и пектинмстнлэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS
4.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449с мутацией в гене gacS
4.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS
4.4.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS к миграции по поверхности среды (сворминг)
5. КЛОНИРОВАНИЕ, СЕКВЕНИРОВАПИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА VFRP. CHLORORAPHIS 449, ИЗУЧЕНИЕ ЕГО РОЛИВ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ
5.1 Идентификация, клонирование и секвепирование гена vfr из P. chlororaphis
5.2 Анализ аминокислотных последовательностей белков — гомологов Vfr и проведение исследования экспрессии гена vfr из P. chlororaphis
5.2.1 Выравнивание последовательностей белков — гомологов Vfr
5.2.2 Клонирование гена vfr из P. chlororaphis 449 в экспрессионном векторе рЕХ20Т
5.2.3 Комплементация мутации в гене сгр в клетках E. coli с помощью гена vfr из Р. chlororaphis 449
5.3 Получение инсерционного мутанта Р. chlororaphis 449 с инактивированным геном vfr
5.4 Исследование влияния мутации в гене vfr на свойства P. chlororaphis
5.4.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr
5.4.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене у fr
5.4.3 Липазная активность в клетках штамма Р. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr
5.4.4 Полигалактуроназная и пекгннметилэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr
5.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr
5.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr
3.4.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в reue vfr к миграции по поверхности среды (сворминг)
6. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ФЕИАЗИНОВОГО ОПЕРОИА P. CIILOROMPHIS 449 И ХАРАКТЕРИСТИКА
мутантных штаммов
В. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING СИСТЕМЫ ВIIПКИ Ol. DER/А CEPACIA, РЕГУЛЯЦИИ,ЕЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СИНТЕЗОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ
1. Определение продукции АГЛ в коллекции штаммов в. cepacia
2. Характеристика штаммов в. cepacia
2.1 Определение с помощью ПЦР генов QS системы CepUCepR в коллекции штаммов В. cepacia
2.2. Изучение продукции потенциальных факторов патогенности у штаммов В. cepacia
2.3 Определение антагонистической активности клинических штаммов В', cepacia по отношению к
P. aeruginosa и S. aureus
3. Изучение QS системы, ее регуляции и роли в регуляции клеточных процессов у В. cepacia
3.1 Клонирование генов ceplu ccpR из В. cepacia
3.1.1 Клонирование гена сер! из В. cepacia
3.1.2 Клонирование гена cepR из В. cepacia
3.2 Получение мутантных штаммов В. cepacia 370 с измененной продукцией АГЛ
3.3 Исследование влияния мутаций в генах pps, clpX, Ion на свойства В. cepacia
3.3.1 Определение продукции АГЛ
3.3.2 Определение экзопротеазной и липазной активности
3.3.3. Подавление роста фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum
3.3.4 Определение гемолитической активности
3.3.5 Определение способности клеток к миграции по поверхности среды (сворминг)
V. ОБСУЖДЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Локализацию пятен проводили визуально, по появлению характерной фиолетовой окраски I репортерного штамма CV026 и по появлению голубых зон гидролиза X-Gal в случае
: репортера NTl/pZLR4, возникающих в присутствии экзогенных АГЛ. В опыте
использовали АГЛ-метчики с концентрациями 0,01 мг/мл для Сб-АГЛ и 0,1 мг/мл для С4-АГЛ, ЗОС6-АГЛ и С8-АГЛ.
5. Методы работы с ДНК
Вьщеление суммарной ДНК, плазмидной ДНК, рестрикцию, агарозный гель-электрофорез, лигирование, трансформацию, блот-гибридизацию по Саузерну проводили согласно методикам, описанным в [6], с небольшими изменениями, принятыми' в
j лаборатории. Реакцию амплификации ДНК (ПЦР) проводили на четырехканальном

программируемом термостате ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология»),
1 Секвенирование последовательностей ДНК проводили* с помощью набора реактивов АВР
| PRISM® BigDye Terminator v.3.1 и последующим анализом продуктов реакции, на

1 автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant в Межинститутском' Центре

коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН
Выделение суммарной бактериальной ДНК. 3-5 мл ночной- культуры, центрифугировали, осадок суспендировали в 5 мл р-ра1 СТЕС (0,35 М сахароза; 50 мМ трис-НС1 (pH 7,5); ЗОмМ ЭДТА; 2,5%саркозил) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Добавляли крупинку протеиназы К и инкубировали при 65°С до Г просветления смеси. Охлаждали, добавляли равный объем смеси хлороформ-фенол (1:1) и
* встряхивали 20 мин при комнатнойтемпературе. Центрифугировали без охлаждения. (10

мин; 4000- об/мин). Отбирали верхнюю фазу и повторно обрабатывали, смесью фенол-

хлороформ: Продолжали обработку до исчезновения промежуточной фазы. Добавляли к последней верхней фазе равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и
>1 встряхивали 10 мин при комнатной температуре. Центрифугировали без охлаждения (10
< мин; 4000 об/мин). Отбирали верхнюю фазу, добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия
! (pH 5,5) и наслаивали по стеночке 2,5 объема 96%-ого этанола. Плавными круговыми
| движениями перемешивали слои, при этом ДНК постепенно выпадала в виде «медузы».
ДНК доставали стеклянной палочкой; промывали 70%-ым этанолом; подсушивали на воздухе. Растворяли в 0,3-0,5 мл ТЕ (50 мМ трис-НС1; 0,1 мМ ЭДТА).
Выделение плазмидной ДНК «щелочным способом». 100 мл ночной культуры центрифугировали (10 мин; 4000 об/мин). Осадок суспендировали в 1,6 мл лизирующего