Закономерности организации гетерохроматиновых районов политенных хромосом Drosophila melanogaster: цитогенетические аспекты

• Автор: Похолкова, Галина Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 280 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Общая характ еристика работы
Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1 Линии мух£>. melanogaster
1.2. Цитологические характеристики 9F12-10A7 X- и 38Е1-2 2L- районов
1.3. Получение новых мутаций
1.3.1. Мутагены
1.3.2. Схемы скрещивания для получения мутаций в районе 9F12-10A7
1.3.3. Получение ревертантов с ослабленным ЭПМ
1.3.4. Получение перестроек с усиленным ЭПМ
1.4. Характеристика полученных мутаций
1.4.1. Определение летальной фазы
1.4.2. Генетическое картирование мутаций в районе 9Е
1.5. Микроскопический анализ хромосом
1.5.1. Приготовление окрашенных препаратов слюнных желёз
1.5.2. Процедура гибридизации in situ
1.5.3. Окрашивание метафазных хромосом
1.5.4. Гистохимическая окраска на (3-галактозидазу
1.5.5. Иммуноокрашивание политенных хромосом
1.5.5.1. Анализ препаратов
1.6. Нозерн-блот анализ
Глава 2. ОРГАНИЗАЦИЯ ПРИЦЕНТРОМЕРНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА
D. melanogaster
2.1 Структурно-функциональная организация прицентромерного гетерохроматина
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
2.1.1 Время формирования гетерохроматиновых блоков
2.1.2. Структурная организация
2.1.3. Репликация гетерохроматина
2.1.4. Эффект положения мозаичного типа
2.1.4.1. Гетерохроматизация эухроматиновых районов
2.1.4.2. Модификаторы ЭПМ
2.1.4.3. Модели эффекта положения
2.1.5. Формирование гетерохроматиновых доменов
2.1.5.1. Нуклеосомная укладка
2.1.5.2. Гистоновые модификации определяют статус хроматиновых доменов
2.1.5.3. Механизмы образования ПГХ районов
2.1.6. Заключение и задачи исследования
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ
2.2.1. Получение ревертаптов без и с ослабленным ЭПМ
2.2.2. Цитологический анализ перестроек чаг7, геч45 и гечПО
2.2.3. Восстановление активности генов у ревертантов геч45 и гечі
2.2.4. Характер компактизации в перестройках ’аг7, геч45 и гечІІО
2.2.5. Мозаичная инактивация гетерохроматиновых локусов
2.2.6. Ревертанты, представленные свободными дупликациями
2.2.7. Длина и структура перенесенного гетерохроматинового фрагмента
2.2.8. Характеристика гетерохроматиновых последовательностей,
прилежащих к точке разрыва в перестройке чаг7
2.2.9.Ревертанты с восстановленным ЭПМ генов в районе 1А
2.3. ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫЕ БЕЛКИ
3.1.Системы эпигенетической регуляции генов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
3.1.1. РоїусотЬ/Тгіїкогах-зависпмая регуляция
3.1.2. Характеристика Рсв и ЦхО белковых комплексов
3.1.3. РКЕ/ТЛЕ- районы связывания
3.1.4. Механизмы действия РсО и ТгхО белков
3.1.5. НР1 - зависимая регуляция
3.1.6. Белок НР1
3.1.7. 8и(УА1Г)3-9-гистонметилтрансфераза
3.1.8. Белок 8и(УАЛ)
3.1.9. Белок НР2
3.1.10. Заключение и задачи исследования
3.2.РЕЗУЛБТАТ Ы
3.2.1. Локализация белка БШЖ у НР1 мутантов

3.2.2. Колокализация НР1 и SUUR белков в условиях гиперфункции гена Su(var)
3.2.3.Связывание белков НР1 и SUUR с тандемными повторами гена
-white
3.2.4. Привлечение белка SUUR в места эктопической локализации белка НР1
3.2.5. Распределение гетерохроматиновых белков в условиях нарушения нормального баланса членов НР1- и PC-комплексов
3.2.6. Специфическое действие SU(VAR)3-9 на ПГХ районы
3.2.7. Локализация белков в ПГХ районах у SuUR Su(var)
3.2.7.1. Гетерохроматиновые белки
3.2.7.2. Эухроматин-специфичные белки
3.3 .ОБСУЖДЕНИЕ
3.3.1.Взаимодействие белков SUURh НР1
3.3.2. Распределение хромосомных белков
Глава 4. РАЙОНЫ ИНТЕРКАЛЯРНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА
4.1. Характеристика ИГХ районов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
4.1.1 Ген SuUR как инструмент изучения ИГХ
4.1.2. Поздняя репликация
4.1.3. Эктопическая конъюгация
4.1.4. Локализация белков
4.1.5. Другие характеристики районов ИГХ
4.1.6. Заключение и задачи исследования
4.2. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.2.1. Частота эктопических контактов и недорепликация ДИК
4.2.2. Время формирования эктопических контактов
4.2.3. Длина молекул ДНК в ИГХ районах
4.2.4. Необычные хромосомные перестройки
4.2.5. Теломерные ассоциации
4.2.6. ЭПМ типа brownD и его связь с ассоциациями гетерохроматиновых
районов
4.2.6.1. Цитологические аспекты bwD

мобильным /-’—элементом и клоны гетерохроматиновой ДНК (Lohe and Roberts, 1988). Клоны были получены Т.Ю. Козловой и присланы A. Lohe.
1.5.3. Окрашивание метафазных хромосом.
С-окрашивание проводили по следующей методики. Нервные ганглии извлекали, инкубировали и фиксировали по методике, приведенной выше, и делали давленные препараты. Затем препараты замораживали, снимали покровное стекло и высушивали в спиртах. После этого их инкубировали в насыщенном растворе Ва(ОН) 3-5 минут при 60°С, споласкивали соляной кислотой, инкубировали в растворе 2SSC 1-1.5 часов при 60°С и окрашивали 2% раствором Гимза.
Окрашивание прометафазных хромосом на выявление Q+- и bL-дисков и флюоресцентное окрашивание in situ гибридизации (FISH) проводили по методикам Gatti et al. (1994). Зонды для гибридизации были получены И.В. Макуниным и мечены biotin-7-dATP.
1.5.4. Гистохимическая окраска на ß-галактозидазу.
X-gal окрашивание тканей и органов, выделенных из личинок и куколок, проводили согласно стандартной процедуре, подробно описанной ранее (Mlodzik and Hiromi, 1992), но с некоторыми модификациями. Так, материал был выделен в РВХ (PBS + 0.3% Triton X - 100) и фиксирован в РВХ/4% формальдегиде 10 - 15 минут. Процедура окрашивания длилась всю ночь при 37°С
1.5.5. Иммуноокрашивание политениых хромосом.
Слюнные железы выделяли в растворе Эфрусси-Бидла, содержащем 1% неионного детергента Nonidet-P40 (NP40) или 1% неионного детергента Tween-20. Через 1-3 минуты железы переносили в формальдегидный фиксатор (0.1 М NaCl, 2шМ KCl, ЮтМ NaPCL, 1% NP40 (1% Tween-20), 2% формальдегид) на 40-50 сек. Затем железы помещали в уксусно-формальдегидный фиксатор (45% уксусная кислота, 3.2% формальдегид) на 1 минуту и давили в 45% уксусной кислоте. Фиксаторы использовали охлажденными на льду. Препараты замораживали жидким азотом, удаляли покровные стекла, дважды по 5 мин проводили через 70% этанол и хранили в этаноле при температуре -20°С не более 1 недели.