Криосохранение семян и протокормов гибридной орхидеи Bratonia

• Автор: Попова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Глубокое замораживание как способ сохранения биоразнообразия растений
1.1.1 Преимущества криосохранения
1.1.2 Особенности криосохранения растительных клеток
1.1.3 Криосохранение семян
1.1.4 Криосохранение изолированных клеток и органов, культивируемых
in vitro
, 1.1.5 Криосохранение орхидных
1.2 Механизмы повреждения растительных клеток при криосохранении:
1.2.1 Образование льда и витрификация в воде и растворах
1.2.2 Повреждения, вызванные образованием внутриклеточного льда
1.2.3 Повреждения, вызванные образованием внеклеточного льда
1.2.4 Другие механизмы повреждений
1.2.5 Роль плазматической мембраны в повреждении клеток при криосохранении

1.3 Криопротекторы
1.4 Основные методы в криосохранении
1.4.1 Медленное замораживание
1.4.2 Витрификация
1.4.3 Другие методы криосохрансния
1.5 Методические особенности криосохранения
1.5.1 Предварительная подготовка культуры
1.5.2 Рекультивирование и регенерация
1.6 Влияние криосохранения семян и культур in vitro на последующее развитие
растений

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объект исследований
2.2 Криосохранение семян
2.3 Получение ювенильных растений
2.4 Получение культуры почкующихся протокормов
2.5 Глубокое замораживание протокормов
2.6 Оценка повреждений протокормов при замораживании-оттаивании
2.7 Изучение влияния глубокого замораживания на развитие семян, протокормов и ювенильных растений
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Криосохранение семян
3.2 Получение ювенильных растений
3.3 Получение культуры почкующихся протокормов
3.4 Глубокое замораживание протокормов
3.4.1 Медленное замораживание
3.4.2 Витрификация
3.5 Оценка повреждений протокормов при замораживании-оттаивании
3.5.1 Окрашивание
3.5.2 Исследование фотосинтетической активности
3.6 Влияние глубокого заморалсивания на развитие семян, протокормов и ювенильных растений
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Orchidaceae является одним из самых многообразных семейств покрытосеменных растений, включающим более 30 ООО видов и 70 000 высокодекоративных гибридов. Семена большинства орхидей имеют маленькие, пылевидные размеры, практически лишены запасных веществ, зародыш мало- или совсем недифференцирован [Поддубная-Арнольд и 1976; Черевченко, Кушнир 1986]. Другой особенностью представителей Orchidaceae является их уникальный цикл развития: эмбрион семени развивается сначала в специфический орган -протокорм, на котором затем формируется апекс побега [Arditti 1977; Батыгина, Васильева 1983]. Многие виды и даже целые роды дикорастущих орхидей занесены в списки CITES как находящиеся под угрозой исчезновения, а декоративные гибриды имеют важное коммерческое значение [Черевченко, Кушнир 1986], поэтому важной задачей становится сохранение разнообразия этого уникального семейства. Сохранение растений орхидей в коллекциях ботанических садов не позволяет полностью решить эту проблему, поскольку такие растения подвержены влиянию условий окружающей среды, нападению болезней и вредителей. Создание банков семян при комнатных, низких положительных и небольших отрицательных температурах также неэффективно для длительного сохранения ценных генотипов, поскольку хранение семян орхидей при таких режимах приводит к быстрому снижению их всхожести [Koopowitz, Thornhill 1994; Никишина и др. 2001]. Возможным решением может стать создание коллекций при сверхнизких температурах, т.е. в криобанке. Этот подход, получивший общемировое признание в последние 10-15 лет, является наиболее надежным, эффективным и экономичным способом сохранения биоразнообразия дикорастущих и культурных растений [Бутенко, Попов 1979; Вепринцев, Ротт 1991; Sakai 2000; Engelmann 2004; Harding 2004]. Однако, как и для большинства декоративных растений, криосохранение орхидей остается экспериментальной областью. Известно чуть более десяти исследовательских работ по криосохранению орхидей [Dubus 1980; Pritchard 1984; Pritchard, Seaton 1993; Ishikawa et al 1997; Pritchard et al 1999; Thammasiri 2000; Wood et al 2000; Никишина и др. 2001; Попова и др. 2003; Popov et al 2004; Hirano et al 2005], в том числе единственная публикация по успешному криосохранению протокормов [Wang et al 1998] и три работы по криосохранению выделенных апексов и культур
1995]. При закаливании морозостойкого сорта озимой пшеницы наблюдали относительное уменьшение площади вакуоли и увеличение площади цитоплазмы, а также увеличение числа хлоропластов на 6-10%, что можно было рассматривать как компенсацию уменьшения числа тилакоидов в гране и, с другой стороны, свидетельствовало об усилении фотосинтетического запасания энергии при адаптации к холоду [Климов и др. 1990; Астахова и др. 1991].
Однако закаливание плохо применимо к чувствительным к холоду (chilling-sensitive) растениям, к каковым относятся тропические виды, и ряд растений средней полосы [Lyons 1973]. В этом случае обработка растений-доноров низкими положительными температурами может быть заменена на выдерживание таких растений на средах с повышенным содержанием осмотически активных веществ, таких как сахара, некоторые спирты и аминокислоты. Иногда сочетают закаливание растений-доноров с предкультивированием выделенных апексов при пониженной или обычной температуре [Grospietsch et al 1999].
Помимо закаливания растений-доноров, для успешного криосохранения часто требуется предварительное культивирование замораживаемых объектов - суспензий, эмбриональных культур или апексов - на средах, содержащих различные вещества, обладающие защитивши свойствами и/или индуцирующие устойчивость. Наиболее часто для этих целей используются сахара, пролин, маннит и сорбит, АБК, реже -глицерин и ДМСО.
Например, предварительное культивирование на среде, содержащей 0.3 М сахарозы в течение суток было необходимо для выживаемости после криосохранения апикальных меристем Cymbidium [Thinli, Takagi 2000], а в течение 3 суток - для эмбриогенных культур пробкового дуба [Valladares et al 2004]. Предкультивирование эмбриогенных культур аспарагуса в среде с 0.8М сахарозы в течение 2 суток повышало их морозостойкость с -8 до -25°С [Fujikawa, Jitsuyama 2000]. В работе Высоцкой использование глюкозы для предварительного культивирования апексов малины оказалось менее эффективным, чем использование сахарозы и снижало выживаемость апексов после криосохранения методом медленного замораживания [Высоцкая и др. 1998]. Этот же эффект позднее наблюдали Dumet с соавт. при криосохранении апексов малины методом инкапсуляции-дегидратации [Dumet et al 2000]. Однако совершенно противоположной оказалась ситуация для апексов