Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae

• Автор: Эйдельштейн, Инна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Смоленск
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Разнообразие и классификация хламидий
1.1. Общая характеристика представителей семейства СЫатусИасеае
1.2. Систематика хламидий
1.2.1. Развитие классификации
1.2.2. Современная классификация и таксономия представителей семейства СЫатусИасеае и их роль в развитии заболеваний
Глава 2. Современные методы выявления и типирования хламидий
2.1. Немолекулярные методы
2.1.1. Морфологические методы
2.1.2. Культивирование
2.1.3. Иммунологические методы
2.2. Молекулярно-генетические методы
2.2.1. Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства СМатусИасеае
2.2.2. Молекулярно-генетические методы, используемые для дифференциации видов СМатусНасеае
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Характеристика штаммов
3.2. Модельные и клинические образцы, использованные для оптимизации ПЦР и выявления хламидий
3.3. Выделение ДНК для ПЦР
3.3.1. Быстрое выделение ДНК с использованием СЬе1ех
3.3.2. Выделение ДНК с использованием протеиназы К

3.3.3. Выделение ДНК с помощью сорбционного метода
3.4. ПЦР-амплификация фрагмента гена отрА
3.5. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей амплификационных фрагментов отрА различных видов Chlamydiaceae
3.6. Получение гетерогенного внутреннего стандарта ПЦР
3.7. Электрофоретическое разделение амплификационных фрагментов отрА в присутствии бисбензимида-ПЭГ
3.8. ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и анализ кривых плавления
3.9. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan-типа (5’-экзонуклеазный метод)
3.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
Глава 4. Результаты и обсуждение
4.1. ПЦР-амплификация и анализ фрагмента последовательности отрА различных видов хламидий
4.1.1. Выбор праймеров и оптимизация ПЦР
4.1.2. Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей
4.2. Разработка и получение внутреннего стандарта ПЦР
4.3. Дифференциация представителей Chlamydiaceae путем электрофоретического разделения в геле с добавлением бисбензимида-ПЭГ
4.4. Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I
4.5. Идентификация Chlamydia spp., Chlamydophilapneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР в режиме реального времени
4.6. Анализ чувствительности и специфичности разработанных методов при исследовании клинических образцов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Би-ПЭГ

ГИФА
ДМСО

ПДРФ

пн, тпн

АТСС

COST
FRET

бисбензимид-полиэтиленгликоль бычий сывороточный альбумин включениеобразующая единица внутренний стандарт
гибридизационный иммуноферментный анализ
диметилсульфоксид
дезоксирибонуклеиновая кислота
дитиотрейтол
иммуноферментный анализ
лигазная цепная реакция
микроиммунофлюоресценция
открытая рамка считывания
полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
полимеразная цепная реакция
пар нуклеотидов, тысяч пар нуклеотидов
рестрикционный анализ
рибонуклеиновая кислота
ретикулярные тельца элементарные тельца
Американская коллекция типовых культур (American Туре Culture Collection)
пороговый цикл (threshold cycle)
Европейское общество сотрудничества в области научных и технических исследований (European Cooperation in the field of Scientific and Technical Research)
резонансный перенос энергии флюоресценции
иммуноглобулин А
иммуноглобулин М
иммуноглобулин G

Трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 5% ПЕГ-8000, и инкубировали 16-18 часов при 4°С.
Компетентные клетки E. coli ТОРЮ (Invitrogen, США) получали с помощью метода, описанного H. Inoue и соавт. [104]. Клетки, выращенные в 250 мл SOB среды (2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, ЮмМ NaCl, 2,5 мМ КС1, ЮмМ MgCl2, ЮмМ MgS04, pH 6,7) до ОПбоо=0,6, охлаждали на льду в течение 10 мин, центрифугировали 10 мин при 2500 g и 4°С. Затем отмывали в 80 мл охлажденного на льду буфера для трансформации - ТВ (10 мМ PIPES, 55 мМ МпС12, 15 мМ СаС12, 250 мМ КС1, pH 6,7) и после повторного центрифугирования ресуспендировали в 20 мл охлажденного ТВ. Добавляли ДМСО до конечной концентрации 7%, инкубировали 10 мин на льду и хранили в виде отдельных порций по 50 мкл при -70°С до проведения трансформации.
Для трансформации в пробирку с 50 мкл размороженных на льду компетентных клеток вносили 2 мкл продуктов лигирования, инкубировали 10 мин на льду, затем 45 с в водяной бане при 43 °С и вновь 10 мин на льду. К трансформированным клеткам добавляли 250 мкл SOC среды (SOB с 20 мМ глюкозой), инкубировали со встряхиванием при 250 об./мин и 37°С в течение 30 мин и рассевали на чашки с агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл X-gal.
Белые или светло-голубые колонии, предположительно несущие плазмиды с инсертированными фрагментами отрА, отбирали для последующего ПЦР-скрининга с праймерами M13F-20 и M13R (5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’ и 5’-CAG GAA АСА GCT ATG AC-3’; Синтол, Россия). ДНК выделяли из отдельных колоний каждого клона путем быстрого лизиса в буфере Lyse-N-Go (PIERCE, США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Состав ПЦР-смеси и протокол амплификации были аналогичны описанным в разделе 3.4, за исключением температуры отжига праймеров - 47°С. Соответствие размера амплификационных продуктов ожидаемому (484-498 пн для разных видов хламидий) определяли с помощью