Механизм ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не имеющих глиоксилатного шунта

• Автор: Филатова, Людмила Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Список сокращений
ЕОбзор литературы
1.1. Общая характеристика фототрофных микроорганизмов
1.2. Углеродный метаболизм пурпурных несерных бактерий
1.2.1. Автотрофная ассимиляция СО2
1.2.2. Гетеротрофный метаболизм
1.2.3. Цитрамалатный цикл
1.3. Задачи исследования
2 Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы исследования
2.1.1. Бактерии и условия их культивирования
2.1.2. Ассимиляция клетками меченых субстратов
2.1.3. Измерение дыхания клеток
2.1.4. Выделение клетками в среду кетокислот
2.1.5. Получение экстрактов клеток
2.1.6. Определение активности ферментов
9 2.1.7. Идентификация продуктов конденсации ацетил-СоА - пируват и
пропионил-СоА - глиоксилат
2.1.8. Определение белка
2.1.9. Реактивы
2.2. Результаты
2.2.1. Активность ферментов, принимающих участие в ассимиляции
ацетата в экстрактах клеток Rba. sphaeroides
2.2.2. Выделение глиоксилата суспензиями клеток Rba. sphaeroides,
выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом
2.2.3. Рост Rba. sphaeroides и Phs.fulvum в разных условиях
2.2.4. Измерение Km для бикарбоната при его ассимиляции клетками
Rba. sphaeroides, Rsp. rubrum и Phs.fulvum, выросшими на ацетате
2.2.5. Ассимиляция ацетата, бикарбоната и пропионата
2.2.5.1. Фиксация ацетата и бикарбоната суспензиями клеток Rba. sphaeroides
и Phs.fulvum, выросших в разных условиях на среде с ацетатом

2.2.5.2. Действие ингибиторов ЦТК на фиксацию ацетата суспензиями клеток КЬа. ірИаєгоіс/ея и РЪ.^. /иИтт, выросших в разных условиях на среде с ацетатом
2.2.5.3. Действие С5 - дикарбоновых кислот на фиксацию ацетата суспензиями клеток ЯЪа. ір)іаегоііІе5 и РИз./иЬит, выросших в разных условиях на среде с ацетатом
2.2.5.4. Фиксация пропионата и бикарбоната суспензиями клеток КЬа. хрИаегоісІеї,
. выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом
і 2.2.5.5. Фиксация пропионата и бикарбоната суспензиями клеток КЬа. sphaeroid.es и
РНз./иЬит, выросших в фототрофных условиях на среде с пропионатом и бикарбонатом
2.2.6. Потребление кислорода суспензиями клеток КЬа. sphaeroides и РИ.ч. /иЪит
2.2.7. Образование и взаимопревращения Сз-дикарбоновых кислот (цитрамалата, 3-метилмалата) в экстрактах клеток КЬа. зрИаегоійез, выросших в фототрофных условиях
на среде с ацетатом
2.2.7.1. Образование цитрамалил-СоА из ацетил-СоА и пирувата
22.1.2. Конденсация пропионил-СоА и глиоксилата с образованием 3-метилмалил-СоА и мезаконил-СоА
З.Обсуждение результатов
Выводы
Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВПФЦ
вцпм
ВЭЖХ
дмсо
ДТНБ

РБФ-карбоксилаза

Трис

ЭДТА
Cfl.
Ect.
Hbt.
восстановительный пентозофосфатный цикл
внутрицитоплазматическая мембрана
высокоэфйективная жидкостная хроматография
диметил сульфоксид
5,5’-дити^ис-(2-нитробензоат)
дитиотреитол
изоцитратлиаза
рибулозо-1,5-бисфосфат
рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа реакционный центр трис(гидроксиметил)аминометан 3-фосфоглицериновая кислота фосфоенолпируват
Фермент катализирует реакцию транскарбоксилирования:
пируват + метилмалонил-СоА —> оксалоацетат + пропионил-СоА,
Определение активности метилцитратсинтазы, акрилоил-СоА гидратазы и карбокситрансферазы показало, что эти ферменты в клетках Rba. sphaeroides отсутствуют (табл. 5). Позитивным контролем при измерении карбокситрансферазы служила культура Propionibacterium freudenreichii. Активность карбокситрансферазы в экстракте клеток Prp. freudenreichii составляла 34 нмоль мин''(мг белка)'1.
Таблица 5. Активность метилцитратсинтазы, акрилоил-СоА гидратазы и карбокситрансферазы в экстрактах клеток ЯЬа. sphaeroides, выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом (в нмоль мин’’(мг белка)'1).
Фермент Активность
Метилцитратсинтаза 0
Акрилоил-СоА гидратаза 0
Карбокситрансфераза 0
Ключевыми ферментами цитрамалатного цикла, обеспечивающего ассимиляцию ацетата у Rsp. rubrum являются цитрамалатсинтаза, катализирующая конденсацию ацетил-СоА и пирувата (табл. 6), и /2-метилмалил-СоА синтаза (табл. 7), осуществляющая конденсацию пропионил-СоА и глиоксилата. Измерение цитрамалатсинтазы проводилось двумя различными методами: по убыли глиоксилата или пропионата, регистрируемого по связыванию с фенилгидразином или по появлению в реакционной смеси СоА, освобождающегося в ходе реакции (тест с ДТНБ). Измерения проводились на клетках, выросших в фототрофных условиях на среде с ацетатом и малатом. В экстрактах клеток Rba. sphaeroides, обнаруживалась активность обоих исследуемых ферментов. Па среде с малатом активность цитрамалат синтазы несколько ниже. Активность /7-метилмалил-СоА синтазы у клеток, выросших на среде с малатом вдвое ниже, чем у клеток выросших на среде с ацетатом.