Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопии

• Автор: Баринова, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 с. : ил.

Глава 1. Обзор литературы
1.1. Подходы к изучению микроорганизмов в их естественных местах обитания
1.2. Требования к методам изучения микроорганизмов в их естественных местах обитания
1.3. Проблема оценки жизнеспособности клеток микроорганизмов в исследованиях
1.4. Применение методов световой микроскопии в изучении микроорганизмов in situ
1.5. Применение методов люминесцентной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ
1.6. Применение методов электронной микроскопии в изучении микроорганизмов ex situ и in situ
1.7. Применение молекулярно-биологических методов в изучении микроорганизмов in situ
1.8. Культуральные методы оценки микробной компоненты экосистем
1.9. Аналитические методы оценки микробной составляющей экосистем
1.10. Заключение обзора литературы
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследований
2.1.1. Керны льда из ледового щита Антарктиды над озером Восток
2.1.2. Осадочные многолетнемёрзлые породы
2.1.3. Нефтешламы Нижнекамского нефтехимического комбината
2.1.4. Гидротермальные источники Камчатки
2.2. Питательные среды, использованные для культивирования
микроорганизмов
2.3. Микроорганизмы и условия их культивирования
2.4. Определение динамики роста культуры Bacillus subtilis :
2.5. Методы световой микроскопии
2.6. Методы электронной микроскопии
2.6.1. Методы препарирования и контрастирования материала
2.6.2. Определение элементного состава
2.6.3. Приготовление ультратонких срезов

2.6.4. Электронно-микроскопическая криофрактография
2.7. Молекулярно - биологические методы
2.7.1. Выделение хромосомной ДНК
2.7.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) гена 16S рДНК
2.7.3. Электрофорез в агарозном геле
2.7.4. Очистка продукта ПЦР и определение количества ДНК
2.7.5. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рДНК
2.7.6. Создание библиотек клонов
2.7.7. Филогенетический анализ
2.8. Измерение интенсивностей процессов хемо- и фото-синтеза
2.9. Измерение физико-химических параметров
2.9.1. Определение окислительно-восстановительного потенциала
2.9.2. Определение газового состава гидротерм
2.9.3. Определение катионно-анионного состава гидро герм
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка и применение метода экспресс-дифференциации биогенных/абиогенных микрообъектов
3.1.1. Обобщение литературных данных по элементному составу бактерий и расчёт области «биогенного»
3.1.2. Определение диапазонов содержания элементов в клетках с различным физиологическим состоянием
3.1.2.1 Изменение ультраструктуры и элементного состава в клетках
Bacillus subtilis в цикле со спорообразованием
3.1.2.2. Изменение ультраструктуры и элементного состава в клетках Bacillus subtilis в цикле с формированием цистоподобных клеток
3.1.3. Анализ кернов атмосферного льда с ледникового щита Антарктиды над озером Восток на присутствие микробной компоненты
3.2. Модификация и применение метода низкотемпературного фракционирование микроорганизмов из образцов с большим содержанием минеральной компоненты
3.2.1. Модельное низкотемпературное фракционирование
3.2.2. Низкотемпературное фракционирование микроорганизмов из грунтов криолитозоны
3,2.2.1. Анализ ультратонких срезов и криосколов фракций клеток, полученных методом низкотемпературного фракционирования

микроорганизмов
3.3. Разработка и применение метода субстратных агаровых каналов
3.4. Модификация и применение метода «микромонолитов»
3.4.1. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в нефтешламовых «микромонолитах»
3.4.1.1. Выявление и исследование бактерии Каіяіїа ad.ipa.ta из нефтешламов
3.4.2. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в цианобактериальных обрастаниях и матах термальных источников
3.4.2.1. Изучение структурно-функционального состояния бактерий в циано-бактериальном мате подножия гейзера Великан
3.4.2.2. Цитологическая и таксономическая характеристика цианобактериальных сообществ гидротерм Восточного термального
поля (Узон)
3.4.2.2.1. Характеристика микробной компоненты из источника О
3.4.2.2.2. Характеристика микробной компоненты из источника Р
3.4.2.2.3. Характеристика микробной компоненты из источника X
3.4.2.2.4. Характеристика микробной компоненты из источника Л
3.4.2.2.5. Характеристика микробной компоненты из источника П
Заключение
Выводы
Библиографический список
Список условных сокращений

3.1.2. Определение диапазонов содержания элементов в клетках с различным физиологическим состоянием
В развитие метода было проведено исследование около 180 клеток бактерии Bacillus subtilis в различных стадиях развития, в том числе со спорообразованием и формированием цистоподобных клеток.
В качестве модели была выбрана культура Bacillus subtilis штамм ВКМ В-720. Выбор данной культуры обоснован следующими причинами:
1) высокая степень изученности;
2) культура способна осуществлять два типа жизненных циклов (со спорообразованием и с формированием цистоподобных рефрактерных клеток) (Дорошенко с соавт., 2001; Цыганкова с соавт., 2004).
3) по бактериям из этого рода уже проводили исследования элементного состава;
4) является широко распространенным микроорганизмом.
Были исследованы клетки в следующих физиологических состояниях: вегетативные, вегетативные стационарные с проспорами, споры, покоящиеся цистоподобные, лизированные, мёртвые с кристаллами. Условия инокулирования и культивирования указаны в Разделе 2 Материалы и методы. В ходе проведения модельных экспериментов бактериальные культуры выращивали в периодической культуре от фазы инициации до фазы отмирания (рис. 11 а, б).
Рисунок 11 а. Кривая роста культуры В. виЫШэ на среде №12 (мясопептонный бульон) в цикле со спорообразованием: а) оптическая плотность (ОП); б) количество жизнеспособных единиц (КОЕ в ІмлхІО7).