Изучение антигенной структуры различных серовариантов возбудителя псевдотуберкулеза с использованием поли- и моноклональных антител

• Автор: Самелия, Жанна Гурамовна
• Шифр специальности: 03.00.07, 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 158 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ПРИНЦИПЫ СЕРОТИПИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГЛАВА 2. АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ИЕРСИНИЙ
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы
3.2. Антигены
3.3. Клеточные линии
3.4. Культуральные среды
3.5. Реактивы и растворы
3.6. Оборудование и приборы
3.7. Методы иммуноанализа
3.7.1. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА)
3.7.2. Эпитопный анализ
3.7.3. Конкурентный ТИФА
3.7.4. Сэндвич-ТИФА
3.7.5. ДОТ - иммуноанализ (ДИА)
3.7.6. Иммуноблот
3.8. Электрофорез
3.9. Лабораторные животные
3.10. Статистические методы
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ СЕРОВАРИАНТАМ У.рзеиЛоыЪегсиШз
4.1. Применение биомоделей определенного генотипа
4.2. Индукция направленной толерантности при неонатальной иммунизации
лабораторных мышей
ГЛАВА 5. ГИБРИДОМЫ - ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ Уpseudotuberculosis
5.1. Оптимизация условий культивирования гибридом
5.2. Клонирование и особенности скрининга позитивных клонов
5.3. Изучение стабильности антителопродуцирующейактивности гибридом ...71 ГЛАВА 6. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНОВ. ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ БАКТЕРИЙ У.рзеис1ошЬегси1ох1х НА ОТДЕЛЬНЫЕ СЕРОВАРИАНТЫ
6.1. Эпитопный анализ
6.2. Молекулярная организация и природа эпитопов, взаимодействующих с МКА
6.3. Специфичность МКА и иммунохимические свойства узнаваемых ими комплементарных лигандов
6.4. Сравнительная иммунореактивность некоторых белков Уpseudotubercidosis
со сходной электрофоретической подвижностью
ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В ТИФА ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ИЕРСИНИОЗОВ И ДРУГИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
7.1. Подбор компонентов для конструирования экспериментальной иммуноферментной моноклональной тест-системы
7.2. Применение экспериментальной иммуноферментной моноклональной тест-системы для иммунохимической характеристики и определения сероваропринадлежности «свежевыделенных»штаммов ¥.рзеис1ошЬегси1о.<;1,ч
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ
БВМ - белки внешней мембраны
ГГ ФРТ - гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза
ДАБ - диаминобензидин
ДИА - ДОТ-иммуноферментный анализ
ДМСО - диметилсульфоксид
КДО - 2-кетодезоксиоктоновая кислота
ЛПС - липополисахарид
м. кл. - микробные клетки
МКА - моноклональные антитела
НЦМ - нитроцеллюлозная мембрана
ОКЗ - острые кишечные заболевания
ОСА - основной соматический антиген
ПААТ - полиакриламидный гель
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ
ТсТ - термостабильный токсин
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ABTS -2.2 - azinobis (3-ethylbenzthiazoline zulfonic acid)
BSA - бычий сывороточный альбумин
lg - иммуноглобулины
IgG - иммуноглобулины класса G
kDa - килодальтон
MD - мегадальтон
OD - оптическая плотность
PBS - фосфатно-солевой буферный раствор
pCad - плазмида кальцийзависимости
pPst - плазмида пестициногенности
SDS - додецилсульфат натрия
FCS - фетальная сыворотка

3,3-Diaminobenzidine (ДАБ), O-dianizidin («Sigma») - субстраты для блоттограмм,
Акриламид, БГ,БР-метилен-бис-акриламид, персульфат аммония, трисаминометан, глицин, додецилсульфат натрия, глицерол, TEMED, 2-меркаптоэтанол («Serva», ДиаэМ) - компоненты для полимеризации гелей и приготовления необходимых буферов,
Н202, НЮ4, AgNOj, СН3СООН, С2Н5ОН, 25% водный аммиак - для окрашивания гелей серебром по методу С.М. Tsai and С.Е. Frasch (270).
3.6. Оборудование и приборы
Для постановки ТИФА использовали 96-луночные планшеты отечественного производства («ВНИИМЕДПОЛИМЕР»), клеточные линии культивировали в 96-луночных планшетах для культур клеток («Flow Laboratories»), а также в пластиковых флаконах объемом 50 см''.
Учет результатов ТИФА осуществляли с помощью 8-канального фотометра «Multiskan» ((.Flow Laboratories») при 405 нм.
Работы с миеломными и гибридомными клетками вели в ламинарном боксе - ЛБ - (ОКБ ТБМ) с горизонтальным потоком воздуха.
Клеточные линии культивировали при 37 С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, в инкубаторе («Labomed»).
Для осаждения клеток использовали центрифугу К 70D при 100 g в течение 10 мин, для очистки иммуноглобулинов из культуральной или асцитической жидкости - К 24D при 3000-5000 g 20 мин.
pH растворов контролировали с помощью иономера И-130. 96-луночные планшеты при постановке ТИФА инкубировали в термостате ТС-80 М-2 при температуре 37°С.
Электрофорез в ПААГ-SDS проводили на аппарате ПЭФ-3, в качестве источника постоянного тока использовали прибор ПЭФА-1.
Для постановки иммуноблота использовали аппарат для полусухого блота с графитовыми электродами.