Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа

• Автор: Красов, Александр Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 108 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика подходов,
обеспечивающих специфическое выявление бактерий в природной среде
1.1.1. Молекулярно-генетические подходы к
выявлению бактерий
1.1.2. Современные методы иммунохимического выявления
и анализа бактериальных антигенов
1.2. Антитела как основной инструмент иммуноанализа
1.2.1. Способы получения антител
1.3. Бактериальные антигены, используемые в качестве
определяемых объектов в иммуноанализе
1.4. Иммуноферментный анализ
1.5. Сложности выявления микроорганизмов в почве
1.6. Характеристика объекта исследования — почвенных
ассоциативных бактерий рода Azospirillum
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Бактериальные штаммы и условия
выращивания бактерий
2.2. Иммунизация животных и получение антител
2.3. Образцы почв, использованных для иммуноанализа
2.4. Инокуляция почвы бактериями A. brasilense Sp245
2.5. Инокуляция растений бактериями
2.6. Иммуноферментный анализ (вариант ELISA)
2.7. Иммунолюминесцентная и лазерная конфокальная
микроскопия почвенных суспензий
2.8. Получение препаратов наружных мембран
2.9. Двойная иммунодиффузия
2.10. Коньюгирование пероксидазы хрена с
кроличьими антителами
2.11. Иммунодот-анализ бактериальных суспензий
Глава 3. Полученные результаты и обсуждение
3.1. Оптимизация условий проведения твердофазного ИФА с использованием Ат на ЛПС для выявления бактерий
рода АгозртИит
3.2. Скрининг методом ИФА коллекционных штаммов
Лгоярй'Шит, выделенных из почв Саратовской области
3.3. Иммуноферментный анализ почвенных суспензий
3.3.1. Выявление специфического антигена интродуцированных в почву бактерий
А. ЬгазИете Бр245
3.3.2. Выявление антигена бактерий А. ЬгаяИете 8р245,
интродуцированных в почву с растениями
3.4. Иммунофлуоресцентная микроскопия образцов почв, инокулированных А. ЬгаяИепяв Бр245, и
иммунодиффузионный анализ бактериальных колоний
3.5. Исследование распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных
типах почв Саратовской области
3.6. Прямой ИФА с использованием родоспецифичных
антител на бактерии рода Аго5рт11ит
Заключение
Выводы
Список использованных источников

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг — антиген
Ат - антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЗФР - забуференный физиологический раствор ИФА - иммуноферментный анализ КОЕ - колониеобразующая единица ЛПС - липополисахарид
ОФДА - ортофенилендиамин
ПХ - пероксидаза хрена
ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль-20000 РИА - радиоиммунологический анализ РНК - рибонуклеиновая кислота ТРИС - трис(гидроксиметил)аминометан ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат ФМСФ - фенилметансульфонилфторид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ELISA - enzyme linked immunosorbent assay, фермент-зависимый иммуносорбционный анализ Ig - иммуноглобулины
IgG - иммуноглобулин G
Real-Time PCR - полимеразная цепная реакция в реальном времени

такой методологии может быть, к примеру, определение специфических для ассоциативного симбиоза изменений ферментативной активности в корне.
Можно выделить несколько этапов в бактериально-растительном взаимодействии, приводящих к установлению ассоциации:
- хемотаксис азоспирилл к корневым эксудатам;
- прикрепление азоспирилл к корням и образование вокруг бактерий фибриллярного материала;
- деформация и разветвление корневых волосков;
-проникновение ряда штаммов азоспирилл внутрь корня и существование их там в метаболически активном состоянии.
В полевых экспериментах по инокуляции растений азоспириллами количество бактерий, выявляемых затем в ризосфере, в 10-100 раз превышает количество азоспирилл, обнаруживаемых вне ризосферы. Эти данные являются одним из свидетельств активной миграции ассоциативных бактерий к корням растений. Считают, что прикрепление азоспирилл к корням обеспечивает их селективное накопление в ризосфере.
Известны три возможных пути проникновения азотфиксирующих бактерий в корни:
- через повреждения корня;
- через корневые волоски (у основания и у кончика волоска - в местах, имеющих только первичную клеточную стенку и плазматическую мембрану);
- между неповрежденными клетками эпидермиса. Полагают, что азоспириллы способны индуцировать увеличение числа эпидермальных клеток корня, образующих чувствительные к инфекции корневые волоски (УаЬа1от 1987).
Так как экто — и эндоризосфера обычно колонизируются разными штаммами азоспирилл, они должны быть специально адаптированы к выживанию и размножению внутри и вне корня. Механизмы активного проникновения азоспирилл в корень и их адаптации к существованию внутри