Биоразнообразие покоящихся форм микроорганизмов

• Автор: Дорошенко, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Состояние покоя у микроорганизмов (метаболическая активность)
1.1.1. Типы покоя: пролиферативный и метаболический
1.1.2. Механизмы развития состояния покоя
1.1.3. Механизмы превращения метаболически покоящихся форм
(образование, прорастание)
1.2. Типы покоящихся форм микроорганизмов
1.2.1. Специализированные покоящиеся формы
1.2.2. Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий (ЖНК, УМБ,
НБ)
1.2.3. Цистоподобные рефрактерные клетки микроорганизмов
1.3. Ауторегуляция образования покоящихся форм микроорганизмов
1.4. Метастабильность фенотипа и основные механизмы ее реализации у микроорганизмов
1.4.1. Понятие
1.4.2. Особенности Я-Б-М-типа диссоциации
1.4.3. Молекулярные и генетические основы диссоциации бактерий
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Получение покоящихся форм бактерий
2.3. Микробиологические методы
2.4. Биохимические методы анализа
2.5. Генетические методы
2.6. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Внутривидовой полиморфизм покоящихся клеток бактерий Bacillus cereus
3.2. Внутрипопуляционное разнообразие фенотипов у бактерий Bacillus cereus
3.2.1. Колониально-морфологические характеристики диссоциантов Bacillus cereus
3.2.2. Физиолого-биохимические характеристики диссоциантов Bacillus cereus
3.2.3. Сопряженность естественной изменчивости с типом покоящихся форм Bacillus cereus
3.3. Образование покоящихся форм диссоциантами Bacillus cereus в условиях репрессии спорообразования и их фенотипическая вариабельность
3.3.1. Влияние среды на развитие и стабильность диссоциантов Bacillus cereus в условиях репрессии спорообразования
3.3.2. Влияние ауторегуляторных факторов dj и d2 на реализацию диссоциативной способности Bacillus cereus
3.4. Фенотипическая диссоциация других бактерий
3.4.1. Популяционная вариабельность Bacillus subtilis
3.4.2. Популяционная вариабельность Stathylococcus aureus
3.5. Возможные механизмы действия ауторегуляторных факторов d] (алкилоксибензолов) в регуляции фенотипической диссоциации бактерий
3.5.1. Микробные алкилоксибензолы (А ОБ) как структурные модификаторы белков
3.5.2. Мутагенный эффект факторов dj (тест Эймса)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Актуальность проблемы. Проблема адаптации организмов к изменяющимся условиям является одной из центральных в биологии. Наибольшей приспособляемостью к флуктуациям окружающей среды обладают микроорганизмы. К эволюционно выработанным и наследственно закрепленным механизмам сохранения вида в неблагоприятных для роста условиях окружающей среды относят способность микроорганизмов образовывать покоящиеся формы (ПФ), различающиеся способами образования, морфологией клеток, параметрами покоя. К настоящему времени наиболее изучено разнообразие морфотипов покоящихся форм, коррелирующее с таксономической принадлежностью бактерий: эндоспоры у бацилл, конидии у актиномицетов, цисты у азотобактера и др. Другой уровень разнообразия покоящихся форм, значительно менее изученный - их внутривидовой полиморфизм, когда различающиеся морфотипы ПФ образуются адаптивно к конкретным условиям развития культуры. Например, у бацилл -эндоспоры [Sussman & Halvorson, 1966] и цистоподобные рефрактерные клетки [Мулюкин с соавт., 1996]; у миксобактерий - миксоспоры [Dworkin & Gibson, 1964] и периферийные клетки [Kim et.al., 1992]; у стрептомицетов - экзоспоры и эндоспоры [Калакуцкий, Агре, 1977; Stastna et.al., 1992]. Разные морфотипы покоящихся форм, как правило, отличаются по глубине метаболического покоя, что связано с различиями в структурной и биохимической организации клетки [Калакуцкий, Агре, 1977; Беккер с соавт., 1987]. Наконец, биоразнообразие, ассоциированное с покоем, проявляется на стадии прорастания покоящихся форм, как развитие варианта (клона, серотипа - в зависимости от определяемых признаков), адаптивно к новым условиям. Интерес к проблеме внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и возможностям ее контроля постоянен. Особенно он возрос в последние годы, поскольку обозначились новые подходы к изучению фенотипической изменчивости как генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция

глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4, Sigma). В качестве химического аналога фактора d] использовали 4-н-гексилрезорцин (Sigma) - амфифильное соединение с рКа=9, который вносили в реакционные смеси в виде раствора в этаноле, так, чтобы конечная концентрация спирта в рабочем объеме равнялась 3-5% (об/об). В контрольных опытах в растворы вносили этанол в эквивалентных количествах. Прединкубацию ферментов с 4-н-гексилрезорцином осуществляли в течение 15-45 минут при 25°С.
Активность РНКазы определяли по скорости накопления кислоторастворимых продуктов гидролиза дрожжевой РНК (Sigma) [Лещинская с соавт., 1980]. Последовательно смешивали 0,1мл раствора РНКазы (0,5мг/мл), 0,2мл 0,2М трис-НС1-буфера (pH 8,5), 0,1мл высокополимерной дрожжевой РНК (0,5мг/мл) и регистрировали прирост кислоторастворимых продуктов по увеличению оптической плотности раствора при А,=260нм.
Активность а-химотрипсина определяли по скорости гидролиза N-бен-зоил-Ь-тирозина (ВТЕЕ). Образующийся продукт реакции имеет спектр поглощения при Х=257нм больше, чем субстрат [Айсина с соавт, 1976].
Приготовление растворов:
1. Концентрация раствора фермента, приготовленного на 0,2М Tris-HCl буфере с pH 7,8 и 0,1 М СаС12, составляла 100мг/мл
2. Приготовление субстрата: ВТЕЕ растворяли в ацетониле, добавляли 0,2М Tris-HCl буфер с рН7,8 и 0,1М СаСЬ, так, чтобы концентрация субстрата была 5х10"4М (172мг/мл).
Реакцию проводили при комнатной температуре. 20мкл фермента вносили в кварцевую кювету с 2мл субстрата, быстро встряхивали и начинали отсчет времени. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-56 с компьютером в режиме кинетики. Скорость реакции определяли по углу наклона кривой, в период 15-75 секунд (линейный участок). Активность выражали в ммоль/л*с с учетом молярного коэффициента (990).