Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики

• Автор: Романова, Людмила Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 298 с. : ил.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ГТЦР - полимеразная цепная реакция
ОП-ПЦР - однопраймерная полимеразная цепная реакция
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
п.н. - пар нуклеотидов
м.к. - микробные клетки
КОЕ - колониеобразующие единицы
ООИ - особо опасные инфекции
Х-£а1 - 5-бромо-4 -хлоро-3-индолил-/3 Б -галактозид
БОБ - додецилсульфат натрия
ИПТГ - изопропил - /3 Б-тиогалактопиранозид
ПААТ - полиакриламидный гель
РНАт - реакция нейтрализации антител
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РАО - реакция агломерации объемной
РКОА - реакция коагглютинации
НФ - некультивируемые формы
НС - некультивируемое состояние

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы
ГЛАВА 1. ТУЛЯРЕМИЯ - АКТУАЛЬНАЯ ПРОБЛЕМА СОВРЕМЕННОГО
ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
2.1. Молекулярное зондирование
2.1.1 .Обзор литературы
2.1.2.Собственные исследования
2.1.2.1 .Материалы и методы
2.1.2.2.Конструирование плазмиды рШЗ 6 с фрагментом ДНК
Б. Цд1агепз1з
2.1.2.3.Характеристика ЕсоШ - фрагмента р!Ш
2.1.2.4.Получение радиоактивного зонда для видоспецифического определения франсиселл
2.1.2.5.Использование зонда для тестирования представителей
Б. ш1агепБ18
2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в диагностике возбудителя туляремии
2.2.1. Обзор литературы
2.2.2.Собственные исследования
2.2.2.1 .ПЦР-генотипирование
2.2.2.1.1.Материалы и методы
2.2.2.1.2. Изучение методических возможностей ОП-ПЦР: генотипирование штаммов различных микроорганизмов и
ДНК-содержащих бактериофагов
2.2.2.1.3.Генотипирование штаммов Б. й11агепз1з
2.2.2.2.ПЦР: детекция представителей Б.ийагегэ

ГЛАВА 3. НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ (НФ) ВОЗБУДИТЕЛЯ
ТУЛЯРЕМИИ
3.1.Обзор литературы
3.2.Собственные исследования
3.2.1. Материалы и методы
3.2.2. Получение и исследование НФ туляремийного микроба
3.2.3. Получение ревертантов НФ туляремийного микроба
ГЛАВА 4. СТРЕССОВЫЙ ОТВЕТ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ

4.1.Обзор литературы
4.2. Собственные исследования
4.2.1. Материалы и методы
4.2.2. Тепловой стресс у возбудителя туляремии
4.2.2.1. Стрессовый ОгоЕЬ- подобный белок
туляремийного микроба
4.2.2.2. Выделение и очистка белка
4.2.2.3. Характеристика белка стрессового белка Ого ЕЬ
4.2.3. Осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии
4.2.3.1.Солетолерантность туляремийного микроба и исследование некоторых биохимических параметров туляремийного микроба в
условиях солевого стресса
4.2.3.2.Исследование морфологии стрессированных клеток возбудителя
туляремии
4.2.3.3Изучение профиля белков туляремийного микроба в условиях
солевого стресса
4.2.3.4.Изучение антифагоцитарной активности стрессированных клеток

туляремийного микроба (положение от 1274 к 1290) всех трех подвидов F.tularensis (тип А, тип В и F.novicida). Зонд оказался видоспецифическим с чувствительностью 105 клеток на пятно. Далее авторы разработали метод для селективной дифференциации штаммов F.tularensis типа А от типа В. В опытах по РНК гибридизации были синтезированы олигонуклеотиды, комплементарные участку 16S рибосомальной РНК F.tularensis в положении 1153. Были получены типоспецифические зонды. Зонд FT1 (5 -CAG ТСТ ТАА TAG А-3 ), комплементарный типу В 16S г РНК, селективно выявлял штаммы типа В, а зонд FT2 (5 -CAG ТСТ САА TAG А-3 ), комплементарный типу A 16S г РНК и F.novicida, гибридизовался только с клетками типа А и F.novicida. Зонды можно было использовать и при исследовании животных, павших от данной инфекции. Чувствительность PITK гибридизации составляла 104 клеток в ткани печени мышей, инфицированных F.tularensis, и 10б клеток для культур, выращенных in vitro. Кроме того, был описан ДНК-зонд к участку ДНК, кодирующему 17кД мембранный белок туляремийного микроба (Sjostedt А., Sandstrom G., Tamvik A., Jaurin В., 1989). Из библиотеки генов ДДК живого вакцинного штамма LVS F.tularensis клонировали в составе вектора фага lgtl 1 2,8 тыс. п.н. фрагмент ДНК F.tularensis. При переклонировании (EcoRI-PvuII) удалось получить фрагмент в 1,2 тыс. п.н., который экспрессировал 17 кД белок наружной мембраны туляремийного микроба. Фрагмент метили изотопом и использовали для ДНК гибридизации с EcoRI-PvuII - рестрицированной хромосомальной ДНК штаммов F.tularensis.
В качестве ДНК-зонда использовали и 1,3 тыс. п.н. фрагмент 23 кД белка F.tularensis LVS (Golovliev I., Ericsson М.,Sandstrom G. et al.,1997).
Родо- и видоспецифические зонды были использованы при исследовании штаммов F.tularensis, выделенных в Центральной Азии, Европе, России и Японии (Sandstrom G., Sjostedt A., Forsman М. et al., 1992).