Выделение ингибиторов РНКаз хроматографическими методами и разработка технологии их производства.

• Автор: Исаев, Андрей Султанович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1990
• Место защиты: Омутнинск
• Количество страниц: 121 с.

СОДЕРМНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРУ
2.1. Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ
с рибонуклеиновыми кислотами
2.2. Ингибирование рибонуклеазной активности
с помощью сорбции РНКаз
2.3. Инактивация рибонуклеаз протеазами и химическими агентами
2.4. Внутриклеточные ингибиторы рибонуклеаз
2.4.1.Ингибиторы РНКаз из прокариотических
клеток
2.4.2.Ингибиторы РНКаз из опухолевых клеток
2.4.3.Свойства ингибиторов рибонуклеаз из
клеток тканей эукариотов
2.5. Методы выделения белковых ингибиторов рибонуклеаз и способы определения их активности
2.6. Применение белковых ингибиторов рибонуклеаз в моленулярно-биологических исследованиях
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
З.Х. Материалы и методы исследований
3.1.1.Сырье, реактивы, материалы и буферные растворы
3.1.2.Подготовка исходного материалы для выделения плацентарного ингибитора и оценка качества
3.2. Результаты и их обсуждение
3.2Л.Определение, активности ингибиторов РНКаз
3.2.2.Сравнительное изучение лабораторных методов выделения ингибитора РНКаз из плаценты человека и оценка путей их усовершенствования
3.2.3.Разработка опытно-промышленной технологии ( "производственной методики") получения ингибитора РНКаз из плаценты человека
3.2.4.Поиск ингибиторов РНКаз в тканях,инфицированных РНК-содержащими вирусами
3.2.5.Выделение ингибитора РНКаз из печени цыплят, больных вирусом птичьего миелобластоза
3.2.6.Сравнительная оценка физико-химических и биологических свойств ингибиторов РНКаз из плаценты человека и из печени цыплят, больных острым миелоб-ластозом
3.2.7.Использование плацентарного ингибитора РНКаз в молекулярно-биологических экспериментах
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
приложения

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,СИМВОЛОВ,ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
ТА -буферный раствор (трис-ацетатный)
Т -буферный раствор (трис-НС1)
ЭДТА -этилендиаминтетрауксусной кислоты,
натриевая соль зізб -додецилсульфат натрия
ДТТ -дитиотреитол
ТХУ -трихлоруксусная кислота
цикло-2’:3’—УМФ -уридин -2’:3’ цикломонофосфат,натриевая
соль
цикло-2’:3’-ЦШ> -цитидин-2’:3’ цикломонофосфат,натриевая
соль
РНКаза А -панкреатическая рибонуклеаза А
РНКаэа -рибонуклеаза
ПЛ-ингибитор -ингибитор рибонуклеаз из плаценты человека
ингибитор Шортмана -ингибитор рибонуклеаз из печени крысы
ЛВС -поливинилсульфат
ОЕ -оптические единицы
ДЭАЭ -хроматографический сорбент-(диэтиламиноэтил)-
целлюлоза
ПААГ -полиакриламидный гель
РСМВ - п-хлормеркурилбензоат
ед.а -единицы активности

Продукты гидролиза ДМФ могут иммобилизоваться на активированную матрицу и увеличивать тем самым ее ионообменные свойства. Для устранения описанного выше явления, мы дополнительно очищали коммерческий препарат ДМФ добавлением в него таблеттированного ЫаОН С 50 грамм на I л ДМФ ) и дистиляцией под вакуумом. С целью понижения уровня неспецифической сорбции на аффинном сорбенте мы провели несколько его синтезов, изменяя их условия.
Синтез № I. Процесс проводили, как описано в работе /I /.
Синтез № 2. Операцию синтеза проводили по работе / I /, но в 0,1 М бикарбонатный буферный раствор с pH 9,5 добавляли 0,5 М хлористого натрия. В этом растворе проводили иммобилизацию РНКазы А.
Синтез № 3. Использовали методику / I /, но для растворения бромциана в процессе активации агарозной матрицы применяли дистиллированный ДМФ.
Синтез № 4. В данном случае синтез аффинного сорбента про-1 водили по следующей схеме. 25 мл влажной сефарозы 4 В отмывали 2 л холодной деионизованной воды на стеклянном фильтре. Затем сефарозу переносили в химический стакан, который помещали в баню со льдом. pH раствора доводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке под контролем рН-метра до значения 11,0. Сефарозу 4 В активировали бромцианом, растворенным в деионизованной воде. Бромшан добавляли из расчета 100 мг на I мл влажного геля. pH реакционной смеси поддерживали в диапазоне значений 10,8 - 11,0 добавлением 2 М едкого натрия. Процесс активации проводили до момента установления постоянного значения pH в реакционной смеси.
По окончании стадии активизации сефарозу быстро отмывали на стеклянном фильтре. Промывку проводили одним литром охлажденноз