Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в гипоталамических структурах головного мозга крыс после антигенного воздействия

• Автор: Носов, Михаил Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.04, 14.00.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ - адренокортикотропньш гормон
ГК - глюкокортикоиды
ИЛ-1 - интерлейкин
ИЛ-2 - интерлейкин
ИС - иммунная система
КРГ ■ - кортикотропин рилизинг гормон
НС - нервная система
рИЛ-2 - рекомбинантный интерлейкин
ЦНС - центральная нервная система
эс - эндокринная система
Агс - аркуатное ядро
АНА - переднее гипоталамическое поле
£Й§*ДНК - меченый дигоксигенином фрагмент ДНК
ОМИ - дорсомедиальное ядро гипоталамуса
ЬНА - латеральное гипоталамическое поле
РВ8 - фосфатно-солевой буфер
РИА - заднее гипоталамическое поле
РУН - паравентрикулярное ядро гипоталамуса
80 - супраоптическое ядро гипоталамуса
УМН - вентрамедиальное ядро гипоталамуса

СОДЕРЖАНИЕ
1,ВВЕДЕНИЕ
2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1.Взаимодействие нервной и иммунной систем
2.1.1.Влияние разрушения и электростимуляции структур головного мозга на протекание
иммунологических процессов
2.1.2.Элек1рофизиологическое исследование активности гипоталомических структур при антигенном воздействии
2.2. ГЕН НЕМЕДЛЕННОГО ОТВЕТА C-FOS
2.2.1.Экспрессия гена c-fos в ЦНС
2.2.2.Экспрессия гена c-fos при антигенном воздействии
2.3.Гумораальные перестройки при иммунизации
2.4. Ген раннего ответа интерлейкин-
2.4.1.Общие сведения
2.4.2.ИЛ-2 в ЦНС
Заключение
3.1. Экспериментальные животные и схема эксперимента
3 ,2.0нределение содержания c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках тканей головного мозга крыс МЕТОДОМ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ
3.2.1 Получение меченых ДНК-зондов
3.2.1.1 Трансформация клетокЕ.соН плазмидной ДНК, содержащей кДНКИЛ-2 или кДНКv-fos
3.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочной экстракции
3.2.1.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами
3.2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.2.1.5. Выделение фрагментов ДНК из лекгоплавкой агарозы
3.2.1.6. Нерадиактивное меченые кДНК-фрагментов дигоксигенином
3.2.2. Приготовление срезов головного мозга
3.2.3.Гибридизация c-fos и ИЛ-2мРНК -dig кДНК
3.2.4.Иммунодетекция комплекса dig*gflHK - мРНК
3.3. Иммунохимическое ВЫЯВЛЕНИЕ c-Fos В ТКАНЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА
3.4. Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Экспрессия c-fos мРНК в клетках структур гипоталамуса крыс после антигенного
воздействия
4.2.Экспрессия c-Fos белка в клетках структур гипоталамуса КРЫС ПОСЛЕ ВНУТРИВЕННОГО
ВВЕДЕНИЯ АНТИГЕНА
4.3. Экспрессия ИЛ-2 мРНК в клетках структур гипоталамуса крыс после внутривенного ВВЕДЕНИЯ АНТИГЕНА
5.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы.
Актуальность проблемы.
Начало развития работ в области иммунофизиологии может быть отнесено к конну XIX, началу XX века, когда впервые, работами И.Г.Савченко (1891), а затем Е.С.Лондона, (1899) было показано влияние перерезки или удаления частей мозга на течение инфекционного процесса. И только несколько десятилетий спустя появились первые предположения об участии мозга в регуляции иммунологических реакций (Метальников, 1926). С этого момента началось целенаправленное изучение влияния разрушения различных структур мозга на протекание иммунологических реакций.
Так в 1927 году Во§еп<1ог1ег в опытах на собаках показал, что перерезка спинного мозга в шейном отделе оказывает тормозящее влияние на образование антител. Позднее в более тонких экспериментах Е.А.Корневой и Л.М.Хай, установлено, что локальное электрическое повреждение области заднего гапоталамического поля сопровождается выраженным подавлением продукции антител (Корнева, Хай 1963), а его электростимуляция ведет к увеличению выработки антител (Корнева и др., 1978). Наиболее выраженные изменения фагоцитарной активности наблюдали при электростимуляции задних и средних отделов подбугорья (ТЪакиг & Мапсйапбе, 1969; Копат & МапсЬапбе, 1970). Таким образом, было установлено влияние разрушения и электростимуляции структур головного мозга на протекание иммунологических процессов.
С 70-х годов началось изучение электрофизиологических изменений в структурах головного мозга в процессе развития иммунологических реакций. Регистрируя количество активных нейронов в треке по наличию нейрональной активности до и после иммунизации БЦЖ Броун с соавторами (1970) обнаружил увеличение числа активных нейронов в области переднего и заднего гипоталамического полей мозга кролика. Анализ нейрональной активности структур гипоталамуса выявил определенную двухволновую динамику: в 1-е -3-е сутки и на 15 сутки после иммунизации кроликов лошадиной сывороткой и

интенсивном встряхивании до тех пор, пока культура не достигала поздней логарифмической фазы (П4бо=0,6). 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе вносили в 500 мл среды ЕВ с ампициллином и инкубировали примерно 2,5 часа при энергичном встряхивании. При достижении О460=0,4 в культуру вносили раствор хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации 170 мкг/мл, после чего клеточную культуру инкубировали при 37°С и интенсивном встряхивании еще 12-16 часов.
Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 4 ООО х § в течение 10 минут при 4 °С и промывали 100 мл охлажденного во льду буфера БТЕ (0,1 М ИаС1, 10 шМ трис-НС1, pH 7,8, 1гаМЭДТА).
Осадок клеток бактерий, полученный из 500 мл культуры, ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозу, 25 мМ трис-НС1 pH 8,0, 10 мМ ЭДТА и лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Суспензию оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 20 мл свежеприготовленного раствора, содержащего 0,2 н ЫаОН и 1% ДДС-Ыа. Смесь инкубировали на льду 10 минут, затем добавляли 15 мл охлажденного ЗМ ацетата натрия, смесь снова инкубировали на льду в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 20 000 об/мин в течение 20 минут при 4°С. К надосадочной жидкости добавляли 0,6 исходного объема изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 15 минут. При этом наблюдали помутнение жидкости. Осадок, полученный в результате последующего центрифугирования надосадочной жидкости при 12 000 х § в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в 5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, pH
8,0, 1мМ ЭДТА). Для очистки плазмидной ДНК проводили равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. К каждому мл раствора ДНК добавляли 1 г сухого хлористого цезия и перемешивали до полного растворения соли. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавляли 0,8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Конечная плотность раствора при этом составляла 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этидия была 600 мкг/мл. Градиент плотности устанавливали