Регуляция метаболизма 2-оксоглутарата с помощью НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы в клетках растений и животных

• Автор: Рахманова, Татьяна Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 207 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л .Метаболизм 2-оксоглутарата и его роль в углеродном и азотном обмене в клетках высших растений и животных
1.1.1. Метаболические превращения 2-оксоглутарата в тканях высших растений и животных
1.1.2. Основные аспекты организации углеродного и азотного обмена
в клетках растений и животных
1.1.3. Взаимосвязь и сопряжение углеродного и азотного обмена на уровне ферментативных превращений 2-оксоглутарага
1.2. Изоцитратдегидрогеназа: формы, свойства и регуляция активности
1.2.1. Реакция, катализируемая ферментом
1.2.2. Распространение и участие в физиолого-биохимических процессах
1.2.3. Изоформы и внутриклеточная локализация НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.2.4. Очистка и физико-химические свойства НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.2.4.1. Очистка НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.2.4.2. Молекулярная масса и четвертичная структура фермента
1.2.5. Кинетическое поведение и регуляция активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.2.5.1. Сродство к субстрату и кофакторам. Субстратная специфичность
1.2.5.2. Влияние температуры и pH среды на активность НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.2.5.3. Взаимодействие фермента с ионами металлов
1.2.5.4. Регуляция активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы под действием интермедиатов клеточного метаболизма
1.2.6. Роль ковалентной модификации и аллостерических эффектов в регуляции активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.3. Субклеточная локализация, свойства и регуляция активности аспартатаминотрансферазы
1.3.1. Реакция, катализируемая ферментом
1.3.2. Распространение и участие ферментав физиологобиохимических процессах
1.3.3. Тканевая и субклеточная локализация АсАТ
1.3.4. Очистка и физико-химические свойства аспартатаминотрансферазы
1.3.4.1. Методы очистки фермента
1.3.4.2. Молекулярная масса и структура фермента
1.3.4.3. Исследования активного центра аспартатаминотрансферазы
1.3.5. Кинетическое поведение и регуляция активности аспартатаминотрансферазы
1.3.5.1. Сродство к субстратам и коферментам.
Субстратная специфичность
1.3.5.2. Влияние температуры и pH на активность фермента
1.3.5.3. Регуляция активности аспартатаминотрансферазы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Выделение клеточных органелл
2.3. Определение активности ферментов
2.4. Определение количества белка
2.5. Выделение и очистка ферментов
2.5.1. Экстракция
2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
2.5.3. Гель-фильтрация
2.5.4. Ионообменная хроматография
2.6. Исследование кинетических характеристик
и регуляции активности ферментов
2.7. Аналитический электрофорез
2.8. Определение молекулярной массы
2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ, РАЗДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФОРМ НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В ТКАНЯХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ
3.1. Распределение активностей НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы в субклеточных фракциях гепатоцитов крысы
3.2. Субклеточная локализация НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы в Spirodela polyrhiza
3.3. Очистка различно локализованных форм НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы из печени крысы
3.3.1. Очистка цитоплазматической и митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы
3.3.2. Очистка цитоплазматической и митохондриальной аспартатаминотрансферазы из печени крысы
3.4. Очистка различно локализованных форм НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы из Spirodela polyrhiza
3.4.1. Очистка цитоплазматической и хлоропластной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из Spirodela polyrhiza
3.4.2. Очистка цитоплазматической и хлоропластной аспартатаминотрансферазы из Spirodela polyrhiza

было изучено субклеточное распределение изоферментов НАДФ-ИДГ в печени и мышце сердца крыс. Были обнаружены как митохондриальные, так и цитоплазматические изоферменты. Активность НАДФ-ИДГ обнаружена также в микросомальных и ядерных фракциях. По-видимому, соотношение активностей цитоплазматической и митохондриальной НАДФ-ИДГ связано с физиологическими особенностями различных тканей (Bell et al., 1968). В ряде работ показано различие каталитических свойств изоформ НАДФ-ИДГ. При изучении частично очищенных митохондриальной и цитоплазматической НАДФ-ИДГ из сердца быка обнаружено, что изоферменты обладают одинаковыми свойствами в отношении их pH, сродства к субстрату и кофакторам. Но отношение их к ингибиторам (ионы Mg2+, Са2+, Си2+, арсенит, n-хлормеркурийбензоат) и количественная потребность в ионах Mg2- и Мп2+ различны. Различия каталитических свойств и субклеточной локализации изоферментов НАДФ-ИДГ связаны с их разным функциональном значением (Higashi et al., 1965). Считают, что функцией цитоплазматической НАДФ-ИДГ является генерирование НАДФН, который используется для различных биосинтетических реакций (Попова, 1993). Некоторые авторы считают, что роль митохондриальной НАДФ-ИДГ заключается в регуляции гликолиза путем изменения уровня цитрата (Smith et al., 1979). Предполагается, что от активности данного изофермента зависит равновесие трансдегидрогеназной реакции, поддерживающей на определенном уровне соотношение окисленной и восстановленной форм НАД и НАДФ, которое оказывает непосредственное влияние на активность НАД-ИДГ, лимитирующей скорость ЦТК (Krawetz et al., 1978; Henson et al., 1986; Землянухин и др., 1987).
Активность НАДФ-ИДГ в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae также связана как с митохондриальной, так и с цитоплазматической фракциями. Оба изофермента экспессируются в большом количестве при выращивании Saccharomyces cerevisiae на несбраживаемых источниках. Во