Роль антиокислительных ферментов в защите эритроцитарного гемоглобина и внеклеточных физиологических сред от перекисной деструкции : Возможность их использования для экологического мониторинга

• Автор: Титов, Владимир Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 251 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
Г. Перекись водорода в живых организмах: физиологическая роль, проблемы защиты
1.1. Основные пути деструкции перекиси водорода в организме
1.1.1. Свободнорадикальный
1.1.1.1. Методы, применяемые для контроля свободнора-
1.1.1.2. дикального разложения перекиси под действием
ионов металлов переменной валентности
1.1.2. Каталазный
1.1.3. Пероксидазный
II. Ферментативные антиокислительные системы организма
II. 1. Каталаза: локализация, структура, механизм действия
ИЛ.1.Методы исследования функциональной эффективности
каталазы в биообъектах
П.2. Глютатионпероксидаза: история открытия,
структура, предполагаемый механизм действия
И.2.1.Методы определения функциональной
эффективности глютатионпероксидазы
П.2.2. Глютатионредуктаза: структура, механизм действия
11.3. Супероксиддисмутаза (СОД): локализация, структура,
механизм действия
П.3.1. Методы определения функциональной
эффективности СОД
11.4. Гемсодержащие пероксидазы: механизм действия, разнообразие функций в живых организмах
11.4.1. Метгемоглобин как пероксидаза
11.4.2. Методы определения функциональной
эффективности гемсодержащих пероксидаз
III. Эритроциты - клетки, наиболее подверженные
Поражению активными формами кислорода
III. I. Окислительная деструкция гемоглобина - ключевое
звено гемолиза в условиях in vivo
111.2. Основные механизмы окисления гемоглобина
под действием различных факторов
III.2.1. Краткие сведения о строении гемоглобина
и механизме его функционирования
Ш.2.2. Активные формы кислорода ~ ключевое звено
окислительной деструкции гемоглобина в аэробных условиях
Ш.2.3. Нитритиндуцированное окисление гемоглобина: физиологическая роль, механизм
111.2.3.1. Нитритиндуцированная меггемоглобинемия:
этиология и основные клинические симптомы
111.2.3.2. Исследование закономерностей развития нитритинду-
цированной метгемоглобинемии в условиях in vivo
IIL2.3.3. Исследование процесса нитритиндуцированного
метгемоглобинобразования на модельных системах
IV. Взаимодействие ферментативных и неферментативных
антиоксидантов в биологических обектах. Аскорбат
IV. 1. Общефизиологическое значение аскорбата
IV.2. Окислительно-восстановительные свойства аскорбата
IV.3. Взаимодействие аскорбата с гемоглобином
IV.4. Аскорбат как субстрат гемсодержащих пероксидаз
IV.5. Метаболизм аскорбата в организме. Роль антиокислительных
ферментов в сохранении его пула
IV.5.1. Роль аскорбата в организме. Современный взгляд на его
физиологическое значение и метаболизм
IV.5.2. Поступление аскорбата в организм человека. Всасывание в
желудочно-кишечном тракте
IV.5.3. Транспорт аскорбата к органам и тканям
IV.5.3.1. Поступление аскорбата в плазму
1V.5.3.2. Усвоение окисленной и восстановленной формы
аскорбата из кровяного русла клетками органов и тканей
IV.5.3.2.1. Различие в проницаемости биомембран окисленной и
восстановленной формой аскорбата. Гипотезы
IV.5.3.2.2. Восстановление дегидроаскорбата в клетках
высших организмов. Физиологическая значимость процесса
IV.5.3.2.3. Различие в усвоении окисленной и восстановленной форм аскорбата тканями синтезирующих и несинтезирующих
аскорбат животных
IV.5.4. Метаболизм аскорбата в организме
IV.5.4.1. Факторы, оказывающие влияние на усвоение
аскорбата клетками и на время его жизни в организме
IV.5.4.2. Закономерности выведения аскорбата и его метаболитов
из организма
IV.5.4.3. Роль крови и, в частности, эритроцитов в поддержании
целостности пула аскорбата
IV.5.4.4. Факторы, влияющие на эффективность восстановления окисленного аскорбата в эритроцитах
IV.5.4.5. Цинга: клинические проявления и предполагаемый патогенез
V. Роль активных форм кислорода во внеклеточных физиологических средах
V.l. Молоко: основные источники активных форм кислорода, их физиологическая роль, системы защиты
VI. Проблемы определения активности антиокислительных ферментов в биологических объектах и их индивидуального вклада в антиокислительную защиту. Необходимость поиска новых методических подходов
VI.1. Проблемы определения вклада перекиси в различных
физиологических и патологических процессах
VI.2. Проблемы соотношения различных путей распада перекиси водорода в биологических объектах и дифференциации
этих путей
VI.3. Воздействие различных факторов на антиокислительные ферменты и на соотношение их активностей
VI.3.1. Взаимодействие нитрита и окиси азота с
антиокислительными ферментами
VII. Использование перекисьметаболизирующих ферментов
для экологического мониторинга
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЕПрепаративные методы
1.1. Приготовление растворов и сред
1.2. Методика выделения эритроцитов
1.2.1. Получение чистого гемоглобина
1.2. Отбор образцов коровьего и женского молока и их
очиситка от липопротеинов
2. Аналитические методы
2.1 Перманганатометрический метод определения концентрации HjOi
2.2. Метод определения содержания нитрита с помощью
реактива НЭД
эритроцитов пероксисомы разрушаются и каталаза оказывается в цитозоле [5]. Как было установлено, каталаза является гемопротеидом, состоящим из четырех равных субъединиц [276]. Синтез белкового апофермента и связывание его с гемом протекает в цитоплазме. В синтезе гема большая роль принадлежит митохондриям [5].
Молекулярный вес катадазы из различных источников лежит в пределах 225000 до 250000 дальтон [22]. В каждой субъединице есть простетическая группа, составляющая активный центр фермента и представляющая из себя протогематин—гидроокись
феррипротопорфирина IX. Железо в гем-группе активного центра интактного фермента находится в трехвалентном состоянии. Четыре места в координационном окружении железа заняты порфириновым циклом, пятое — имидазольным остатком гистидина из белкового апофермента, а у шестого места происходит присоединение Н202 или конкурентов-ингибиторов фермента: сульфидов, цианидов, фторидов, азидов, гидроксил-аминов [159]. Четыре субъединицы каталазы связаны между собой посредством гидрофобных взаимодействий между глобулами апофермента [276], хотя у каталазы из печени мыши между субъединицами имеются мостики из сиаловых кислот [159]. Считается, что свою основную реакцию — разложение Н2О2 фермент может выполнять только в тетрамерной форме [159].
Существует и противоположное мнение, что для выполнения каталитического разложения НгОг достаточно и одной субъединицы [22]. Но вполне возможно, что здесь сильного противоречия и нет. Возможно, четырехсубъединичная форма придает активному центру стерическую конформацию, необходимую для проведения каталитической реакции, в то же время как самого активного центра достаточно одного. Под действием сильнощелочной среды происходит диссоциация фермента на четыре равные субъединицы [158]. Изолированные субъединицы не обладают каталазной активностью, но сохраняют пероксидазную активность [158]. Под действием мочевины, при обработке трипсином, а также при инкубации в кислой среде каталаза диссоциирует на две субъединицы. Они также не проявляют каталазную активность [267]. Устойчивость к диссоциации у ферментов, полученных из разных источников, разная. Так у бактериальной каталазы устойчивость к диссоциации в щелочной среде выше, чем у каталазы из печени быка [159]. В работе Самоджимы и сотр. [267] показано, что субъединицы каталазы быка, полученные при высоких pH, могут вновь соединяться и