Влияние неорганического фосфата и кофермента на термостабильность нефосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

• Автор: Арутюнов, Денис Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДСр - Избыточное теплопоглощение
ДНса1 - Калориметрическая энтальпия
вАРИ - Нефосфорилирующая глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназа
Тмакс. - Температура максимального теплопоглощения
Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан
ГАФД - П-Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа
(фосфорилирующая)
ДСК - Дифференциальная сканирующая калориметрия
ДСН - Додецилсульфат натрия
ДТНБ - Дитио-(бис)-нитробензойная кислота
Кп - Константа диссоциации
Кт - Константа Михаэлиса
К-Р1 - Фосфат калия
КД - Круговой дихроизм
МЭТ - (3-меркаптоэтанол
ПААГ - Полиакриламидный гель
3-ФГ - 3-фосфоглицерат
3-ФГА - Глицеральдегид-3-фосфат
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Часть 1. Концепция разобщения окисления и фосфорилирования на
стадии гликолитической оксидоредукции
Часть 2. Общая характеристика фосфатаз 1,3-дифосфоглицерата
Полисубстратная ацилфосфатаза
Фосфорилирующая дегидрогеназа фосфоглицеринового альдегида,
содержащая остаток сульфеновой кислоты в активном центре
Часть 3. Структурно-функциональные особенности
нефосфорилирующих дегидрогеназ 3-ФГА
Ферредоксин-зависимые нефосфорилирующие дегидрогеназы
фосфоглицеринового альдегида
NAD(P)-3aeuciiMbie нефосфорилирующие дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида: происхождение, распространение,
структура и функция
Реакция окисления 3-ФГА, катализируемая GAPN, субстраты и
ингибиторы фермента
Структура ЫАП(Р)-зависимой нефосфорилирующей
глицеральдегид-3 -фосфат дегидрогеназы
Распространение и происхождение нефосфорилирующей ФГА-
дегидрогеназы
Физиологическая роль GAPN у различных организмов
Особенности строения активного центра и механизм катализа NADP-зависимой нефосфорилирующей дегидрогеназы
фосфоглицеринового альдегида из Streptococcus mutans
Структура апо- и холо-фермента по данным кристаллографических исследований
Влияние различных мутаций в области активного центра на
каталитические свойства GAPN S. mutans
Гипотетическая схема катализа,
осуществляемого GAPN S. mutans
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение GAPN Streptococcus mutans
Получение цитоплазматической фракции ферментов из мышц крысы
Аналитические методы
Определение точных концентраций некоторых реагентов
Определение концентраций белков
Определение концентрации лактата в мышечном экстракте
Определение ферментативной активности ГАФД и GAPN
Определение фосфата в препаратах GAPN
Модификация сульфгидрильных групп ГАФД и GAPN, при помощи

Инактивация ГАФД и GAPN реагентами на сульфгидрильные
группы
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Дифференциальная сканирующая калориметрия
Регистрация спектров кругового дихроизма
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Часть 1. Индуцированный анионами переход между двумя формами
нефосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы
Обнаружение двух форм апофермента дикого типа, различающихся по термостабильности и электрофоретической подвижности .... 74 Влияние pH среды на характер термограмм апофермента GAPN
дикого типа
Возможный участок связывания аниона с молекулой GAPN
коэнзима: (ßa)g-6o40HOK у суперсемейства альдозоредуктаз; ßaßotß-
мотив - "классическая" складка Россмана, имеющаяся, в частности, у суперсемейства алкогольдегидрогеназ и фосфорилирующих ГАФД; ß,аД-складка (модифицированный "Rossman fold") у суперсемейства альдегиддегидрогеназ (Habenicht, 1997). Можно выделить еще особый характер коэнзим-белкового взаимодействия в области пирофосфатной части кофактора. Так, показано, что взаимодействие между пирофосфатом динуклеотида и белком осуществляется петлей между тяжом ßj и спиралью а8. При этом характерным мотивом в области связывания пирофосфата будет не известный для фосфорилирующих ГАФД мотив GXGXXG (Wierenga et al., 1986), a GSTX2G (Cobessi et al., 1999. Впервые этот мотив был описан, как "GX4G" Liu et al., 1997). Мотив GSTX2G является консервативным мотивом пирофосфат-связывающего участка белков суперсемейства альдегиддегидрогеназ. Распространение и происхождение нефосфорилирующей ФГА-дегидрогеназы
Первоначально GAPN была обнаружена только у фотосинтезирующих эукариот (Amon et al., 1954), однако затем появились сообщения об обнаружении активности этого фермента в экстрактах клеток Streptococcus mutans и Streptococcus salivarius (Brown and Wittenberger, 1971). Более того, как уже говорилось, GAPN была обнаружена в клетках термофильной археи Thermoproteus tenax (Hensel et al., 1987; Brunner et al., 1998). Позднее гены растительной, архейной и бактериальной GAPN были клонированы.
Нефосфорилирующая глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа обнаружена в цитозоле представителей всех отделов водорослей и высших растений (Valenti et al., 1986; Mateos and Serrano, 1992). Следует отметить, что у высших растений GAPN имеет тканеспецифичную локализацию, а именно в клетках мезофилла,