Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы

• Автор: Дьяченко, Екатерина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Выделение и получение препаратов изоцитратлиазы в высокоочищенном состоянии из разных организмов
1.1.1. Механизм действия изоцитратлиазы
1.1.2. Характеристика способов выделения изоцитратлиазы из растений, животных и бактерий
1.1.3. Пространственная структура и конформационное состояние молекулы изоцитратлиазы
1.1.3.1. Молекулярная масса и субъединичное строение фермента_
1.1.3.2. Пространственная структура молекулы изоцитратлиазы, особенности вторичной, третичной структуры
1.2. Регуляция активности изоцитратлиазы на разных этапах развития организмов и её физиолого-биохимическая роль
1.2.1. Распространение изоцитратлиазы в организмах различных таксономических групп
1.2.1.1. Распространение ферментов ГЦу микроорганизмов
1.2.1.2. Функционирование глиоксилатного цикла у грибов
1.2.1.3. Распространение изоцитратлиазы у низших и высших растений
1.2.1.4. Изоцитратлиаза в тканях животных
1.2.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы
1.2.2.1. Микротельца в растениях
1.2.2.2. Внутриклеточная локализация ИЦЛ
1.2.3. Изоферментный состав
1.2.4. Регуляторные и кинетические характеристики изоцитратлиазы
1.2.4.1. pH оптимум
1.2.4.2. Температурный оптимум
1.2.4.3. Константа Михаэлиса
1.2.4.4. Влияние катионов металлов
1.2.4.5. Регуляция метаболитами
1.2.5. Физиологическое значение изоформ ИЦЛ у различных организмов
1.3. Молекулярные аспекты функционирования изоцитратлиазы в различных организмах
1.3.1. Экспрессия и регуляция фермента
1.3.1.1. Экспрессионная регуляция ИЦЛ
1.3.1.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ
1.3.2. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
1.3.3. Эволюционные аспекты ферментов ГЦ
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Объект и методы исследования
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Методы исследования
2.1.2.1. Определение активности изоцитратлиазы
2.1.2.2. Определение количества белка
2.1.2.3. Исследование субклеточной локализации
2.1.2.4. Схема очистки изоцитратлиазы
2.1.2.5. Электрофоретические исследования белков
2.1.2.5.1. Определение гомогенности ферментов
2.1.2.5.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы
2.1.2.5.3. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na-ПААГ-электрофореза
2.1.2.6. Хранение высокоочищенных ферментативных препаратов изоцитратлиазы
2.1.2.7. Определение молекулярной массы нативного
фермента

2.1.2.8. Исследование кинетических и регуляторных
характеристик изоформ изоцитратлиазы
5 2.1.2.9. Экстракция суммарной РНК
2.1.2.10. Проведение обратной транскрипции
2.1.2.11. Подбор праймеров
2.1.2.12. Проведение полимеразной цепной реакции
2.1.2.13. Секвенирование ПЦР-продукта
2.1.2.13.1. Экстракция фрагментов ДНК из ПААТ
2.1.2.14. Проведение ПЦР в реальном времени

2.1.2.15. Статистическая обработка данных
2.2. Результаты и их обсуждения
2.2.1. Физиолого-биохимические аспекты функционирования изоформ изоцитратлиазы в растениях
2.2.1.1. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях с различным типом основного метаболизма
f 2.2.1.2. Электрофоретические исследования изо ферментного
состава изоцитратлиазы в растениях с разным типом основного метаболизма
2.2.1.3. Динамика активности ИЦЛ и ключевых ферментов основных метаболических путей в онтогенезе кукурузы
2.2.1.4. Электрофоретическая подвижность изоцитратлиазы в разных органах Zea mays L при проростании

2.2.1.5. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы
в щитках кукурузы
2.2.2. Очистка, физико-химические, кинетические и регуляторные изоформ изоцитратлиазы из разных органов Zea mays L
2.2.2.1. Очистка изоформ ИЦЛ из щитков

клетки и обусловливают сопряжение процессов, протекающих в различных клеточных компартментах, в частности в хлоропластах и митохондриях [101]. В осуществлении этих реакций важная роль принадлежит и пероксисомам (микротельцам) - органеллам, в которых окисление не связано с генерацией энергии. Впервые эти органоиды были открыты К. де Дювом, который считал, что пероксисома — это органелла, выполняющая ту же функцию, что и митохондрия, только в ней окисление не сопряжено с генерацией НАДН и АТФ. Процессы, протекающие в микротельцах, оказываются существенным моментом объединения: потоков метаболитов в растениях в целостную систему. По имеющимся данным, микротельца играли важную роль в эволюции метаболизма растений [17].
Пероксиосмы, в отличие от пластид и митохондрий, которые ограничены двумя мембранами, представляют собой сферические органеллы, окруженные одной мембраной. Их диаметр колеблется от ОД до 1,5 мкм. Микротельца имеют гранулярное содержимое, иногда в: них встречаются и кристаллические белковые включения. Эти органойды обычно связаны с одним или двумя участками эндоплазматического ретикулума. Все типы пероксисом морфологически неразличимы, имеют одинаковую плотность, что, позволяет считать их разными специализациями одной органеллы. Специализация микротелец достигается за счёт приобретения ими специфических ферментных систем, которые обеспечивают протекание метаболических реакций, сопряжённых с флавинзависимым окислением и разложением перекиси водорода каталазой [38, 57, 141, 178].
В тканях, в которых происходит мобилизация жиров - в семенах при прорастании - выявляются глиоксисомы - разновидность микротелец, в которых происходит окисление жирных кислот и глиоксилатный цикл. Образующийся в них сукцинат направляется на синтез углеводов [75, 89, 132, 133].